UPLC-MS/MS测定羊奶和羊奶粉中安乃近残留量

李璐，杨家秀，王聪，董文君，张艳*

1.富平县检验检测中心 （陕西省羊乳产品质量监督检验中心）（富平 711700）；2.陕西圣唐乳业有限公司 （富平711700）

安乃近（metamizole sodium），是氨基比林和亚硫酸钠的络合物，属于吡唑酮类的非甾体类解热镇痛抗炎药，通过抑制前列腺素（PG）合成酶（环氧酶，COX-1、COX-2和COX-3），减少前列腺素合成而发挥药效[1]。人因个体差异或不当使用会引起严重的不良反应，如皮疹、坏死性肠炎、再生障碍性贫血、肝肾功能异常、过敏性休克等[1]，美国、澳大利亚、日本等30多个国家已禁用或限用该药。2020年我国停止安乃近注射液等品种的使用[2]，修订安乃近片对妊娠晚期妇女和18岁以下青少年儿童禁用[3]。安乃近是兽医临床常用的治疗药物，对大型家畜的使用产生的不良反应通常不被人们重视。肌肉给药24 h后，牛奶中残留标志物4-甲基氨基安替比林浓度占总残留的比例为27%[1]，羊奶中代谢残留研究尚未见诸报道。国家要求食品动物的休药期为28日，禁奶期为7日[4]，准确检测安乃近的残留量成为市场监管的必然要求。国家标准中规定安乃近在羊奶中的最大残留限量为50 μg/kg[5]，与欧盟标准的规定相同[6]，羊奶粉根据出粉率折算成羊奶进行判定。

安乃近的检测方法有分光光度法[7]、流动注射化学发光光度法[8]、薄层色谱法[9]、液相色谱法[10]、液相色谱-质谱联用法等[11]，其中超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS/MS）技术有助于降低内源性物质的干扰[12]，适用于痕量药物残留的测定[13]。羊奶与牛奶的营养素构成和维生素、矿物质含量存在明显差异[14]，所以亟须建立针对羊奶和羊奶粉中安乃近残留量的检测方法，对日常风险监测及地理标志产品的保护均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine，纯度≥ 99.1%）、4-乙酰氨基安替比林（4-acetylaminbantipyrine，纯度≥99.9%）、4-甲基氨基安替比林（4-methylaminoantipyrine，纯度≥99.9%）：天津阿尔塔科技有限公司；4-甲酰氨基安替比林（4-formylaminoantipyrine，纯度≥99.9%，坛墨质检科技股份有限公司）；4-异丙基氨基安替比林-D6（4-isopropylantipyrine-D6，纯度≥99.9%，北京曼哈格生物科技有限公司）；甲酸、乙酸铵、异丙醇（色谱纯，阿拉丁试剂有限公司）；甲醇、乙酸、乙腈（色谱纯，德国默克公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris，分析纯，天津市光复精细化工研究所）；羊奶和羊奶粉（陕西圣唐乳业有限公司）。

超高效液相色谱-质谱联用仪1290-G6460C（配ESI离子源，美国安捷伦公司）；BEH C18色谱柱（柱长50 mm，柱内径2.1 mm，填料粒径1.8 μm，美国安捷伦公司）；MTN-5800A-24氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；H20-I-1-UV-T超纯水机（德国赛多利斯集团）。

1.2 试验方法

1.2.1 液相洗脱条件和质谱条件的选择

分离条件以GB/T 22971—2008《牛奶和奶粉中安乃近代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[15]为基础，依据仪器条件和色谱柱的不同进行调整，使4个组分能充分被识别。

1.2.2 样品制备方式的选择

按照提取、浓缩的步骤制备试样，以回收率和精密度考察方法的准确性。回收率的计算参考GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[16]中附录F的F.1，精密度参考F.3。

1.2.3 定量限的测定

在羊奶和羊奶粉中添加目标化合物，做平行样，测基线噪音值，依据特征离子色谱峰rSN＞10为方法定量限[16]，测定方法的定量限。

2 结果与分析

2.1 液相洗脱条件和质谱条件优化

2.1.1 色谱条件

色谱柱C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温40 ℃；流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为0.1%甲酸乙腈；梯度洗脱：0～4.0 min、90%～75% A，4.0～6.0 min、75%～70% A，6.0～10.0 min、70%～90% A；流速0.25 mL/min；进样量2 μL。

2.1.2 质谱条件

电离方式ESI+；雾化器压力35 Psi；毛细管电压2 500 V；干燥气温度325 ℃；干燥气流速12 L/min；多反应监测（MRM）模式。化合物的其他参数见表1。

表1 各组分质谱分析参数

有机相采用甲醇时，由于第1个峰出峰早，所以出现肩峰现象，更换有机相为乙腈后峰形完好，调整使用乙腈作为有机相。当使用0.1%甲酸时，室温下流动相的pH约2.5，并且同加入乙酸铵和乙酸时峰形和峰面积差异不显著，所以不使用乙酸铵和乙酸作为流动相，也避免盐类对质谱可能造成的损害。优化洗脱梯度后（见2.1.1），4个组分得到有效识别，浓度约100μg/L时的结果见图1。

图1 总离子流图及定量多反应监测结果

2.2 提取条件的优化

为避免羊奶中含有大量的小分子蛋白质等物质的干扰，采用增大乙腈加入量进行提取，并且减少提取次数至1次，避免多次提取时小分子化合物使溶液浑浊，以减少基质效应产生的不良影响，也简化了提取步骤，提高了提取效率。

2.3 样品制备

称取5.00 g羊奶，置于50 mL带刻度的聚丙烯离心管中，加入50 μL 1.0 mg/L内标工作溶液、0.5 mL 1.0 mol/L的Tris溶液及20 mL乙腈，涡旋混合1 min，振荡提取15 min，于4 ℃，5 000 r/min离心5 min，上清液转移至25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，作为提取液。取5.0 mL提取液至10 mL玻璃刻度管中，加入5.0 mL异丙醇，混匀，于40 ℃氮吹至近干，加入1.0 mL初始流动相溶解，混匀后过0.22 μm滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱测定。

称取12.5 g羊奶粉于100 mL烧杯中，加适量水（35～50 ℃）溶解，冷却后加水至总质量100 g，混匀，按照上述羊奶的步骤处理。

2.4 内标量的优化

4-甲基氨基安替比林的测定采用4-异丙基氨基安替比林-D6作为同位素内标。选定内标化合物之后，关键在于确定合适的内标浓度[17]。内标浓度太大，前处理时损失的内标量也多，出于经济节约考虑，在能够满足测定需求的前提下，内标的上机浓度选为最低浓度10 μg/L。

2.5 线性范围、线性方程和定量限

吸取约0，50，250，500，1 000，2 000和5 000 μL 0.2 mg/L混合标准液及100 μL 1.0 mg/L内标工作溶液，用空白基质溶液定容至10 mL容量瓶中，得到基质混合标准系列溶液，现用现配。4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林采用外标法定量，4-甲基氨基安替比林以4-异丙基氨基安替比林-D6作为内标采用内标法定量。以峰面积（或与内标峰面积的比值）（y）为纵坐标，标准品质量浓度（x）为横坐标，进行线性回归拟合，各组分回归方程结果如表2所示。相关系数R2＞0.995，线性关系良好，符合要求。

表2 4种组分的线性方程、相关系数

按照定量限的测定方法，离子色谱峰rSN＞10，测定定量限。4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林和4-甲基氨基安替比林的定量限分别为2.8，3.9，0.088和1.4 μg/kg。

2.6 重复性

在羊奶和羊奶粉样品中分别添加约5和40 μg/kg的标准品进行重复性试验，每个添加水平重复6次，计算变异系数（C.V.），结果见表3。变异系数为0.3%～ 2.0%，符合要求。

表3 羊奶和羊奶粉中安乃近的重复性（n=6）

2.7 回收率和精密度

在样品基质中添加4个水平（羊奶约5，10，20和50 μg/kg；羊奶粉约40，80，160和400 μg/kg）的标准品进行加标回收试验，计算回收率，每个添加水平重复6次，结果见表4。结果表明，4个组分的回收率为83.6%～100.2%，相对标准偏差（SRSD）为0.3%～ 6.5%，方法的回收率和精密度能够满足定量分析要求，结果准确可靠。回收率按式（1）计算。

表4 羊奶和羊奶粉中安乃近的回收率和精密度（n=6）

回收率=（测得值-本底值）/添加量×100%（1）

2.8 样品检测结果

随机抽取市场上3份样品同质控样品一并按照上述建立的超高效液相色谱-质谱联用法进行检测，结果见表5。抽取的羊奶样品均没超过国家标准中规定的安乃近的最大残留限量50 μg/kg。一般情况下羊奶粉的出粉率约12.5%，安乃近的最大残留限量折算成羊奶粉约400 μg/kg，抽取的羊奶粉样品也没超过该值。并且质控样品测得值准确可靠，这3份样品中安乃近残留量远不会对人体产生伤害作用。

3 结论

羊奶和羊奶粉复溶后加入Tris溶液，采用乙腈沉淀蛋白并提取安乃近残留物，等量加入异丙醇促进氮吹浓缩的方式，建立一种超高效液相色谱-质谱联用技术同时测定4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林和4-甲基氨基安替比林残留量的方法。该方法前处理操作简单，节约试剂耗材，用时短，既灵敏又准确，具有一定优越性，能够很好地测定羊奶和羊奶粉中安乃近残留量，可用于日常风险监测，提高市场监管水平。