一株茶毒蛾病原细菌的分离、鉴定及致病性测定

张倪铭, 陈李林, 倪德芳, 李文凯, 童应华

(1.福建农林大学林学院;2.福建农林大学植物保护学院,福建 福州 350002)

茶毒蛾(EuproctispseudoconspersaStrand),隶属鳞翅目(Lepidoptera)毒蛾科(Lymantriidae)黄毒蛾属(EuproctisHübner),又称茶毛虫、茶黄毒蛾、油茶毒蛾、摆头虫等[1],是山茶属植物的重要害虫,主要为害油茶(CamelliaoleiferaAbel)、茶[C.sinensis(L.) O. Kuntze][2],分布于我国福建、江西等省及日本[1,3]、朝鲜[4]、越南[1]、印度[1]等国。该虫在福建一年发生3～4代[5],以卵块附着于下部叶片背面越冬[1,6],幼虫取食油茶或茶树嫩梢[3,5,7];寄主受害后,嫩梢呈焦枯状,树势减弱,油茶茶籽产量降低[2],连年遭害将死亡[8]。

目前,对茶毒蛾的种群控制以喷雾[8]、烟剂[9]等化学防治为主,辅以人工摘除幼虫和卵块[2]、清除枯叶和杂草[2]、垦复[2]及灯光诱杀[7-8]等物理防治。在生物防治方面:李秋玲[7]和包强等[10]研究表明,浓度为1.0×108个·mL-1的白僵菌孢子悬浮液对茶毒蛾幼虫的防治效果较好;刘元兵[11]和林曦碧[12]研究发现,多个球孢白僵菌菌株对茶毒蛾有较高致病力;另外,有学者研究了茶毛虫核型多角体病毒(E.pseudoconsperanuclear polyhedrosis virus, EpNPV)[13]、茶毛虫布尼亚病毒(E.pseudoconsperabunyavirus, EpBYV)[14-15]、性引诱剂[4,16-18]、捕食性天敌[1,19]和寄生性天敌[3,20]等对该虫的防治效果。苏云金芽孢杆菌(BacillusthuringiensisBerliner, Bt)用于防治茶毒蛾的历史较久[21],是目前使用最广泛的病原细菌[22]。林间喷施Bt和杀螟杆菌(B.cereusFrankland)防治茶毒蛾3龄以下幼虫,防治率达80.00%以上[2,7]。此外,Bt对EpNPV有增效作用[23],EpNPV-Bt混剂对茶毒蛾幼虫有较好的田间防治效果[24-25]。

茶毒蛾幼虫易发生细菌性软腐病[1],且该虫具有群聚取食的习性[6],有利于病原细菌的传播、扩散而诱发流行病。但有关茶毒蛾病原细菌的分离、鉴定及致病力少有报道。本研究从茶毒蛾病死幼虫虫体上分离得到一株病原细菌,通过室内测定评价其对茶毒蛾的致病性,为茶毒蛾的生物防治提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 菌种的分离、纯化

1.1.1 病死虫处理与病原细菌的分离、纯化 自然感染细菌的茶毒蛾病死幼虫采自福建省屏南县棠口乡安溪村茶园(26.969°N、118.972°E),寄主为茶。以75%(体积分数)酒精擦拭虫体表面,无菌操作下,用无菌接种环刮取病虫腹部末端流出的体液,适当稀释于无菌水中,涂布于NA平板培养基(蛋白胨10 g,NaCl 5 g,牛肉膏3 g,琼脂20 g,加水至1 L)上,置于33 ℃恒温培养箱中倒置培养。2 d后,采用4区划线法[26],3次划线分离,直至用Nikon E100光学显微镜观察到单一菌种,命名为Nan-Y。

1.1.2 回接感染试验 采用喂食法进行回接感染试验。于NA平板培养基上培养Nan-Y菌株2 d后,用无菌水将菌落洗至无菌三角瓶(100 mL)中。将新鲜茶树嫩叶浸泡于菌液中,20 s后取出,饲喂健康茶毒蛾幼虫,观察幼虫的感染症状,并从死亡虫体分离、纯化病原菌,观察菌体与菌落特征是否与原病原菌相同。

1.2 病原细菌的形态观察

将Nan-Y菌株接种于NA平板培养基上,于33 ℃恒温培养箱中倒置培养。观察、记录菌落形态、颜色、生长状况等,以革兰氏染色法[27]将菌体染色后,在Nikon E100光学显微镜下观察并拍照。

1.3 病原细菌的分子鉴定

1.3.1 细菌DNA提取与16S rDNA序列扩增 将Nan-Y菌株接种于液体NA培养基摇瓶中,33 ℃、110 r·min-1培养12 h,以离心柱法提取DNA。采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。

PCR(20 μL)反应体系:10×ExTaqbuffer 2.0 μL,5 U ExTaq0.2 μL,2.5 mmol·L-1dNTP Mix 1.6 μL,27F/ITS1 1.0 μL,1492R/ITS4 1.0 μL,DNA 0.5 μL,ddH2O 13.7 μL。

PCR反应程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30个循环;72 ℃补充延伸10 min。取扩增产物5 μL经0.8%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳,成像系统成像[28]。

1.3.2 PCR产物测序分析 江西师范大学国家科技园对PCR扩增产物进行测序。在NCBI数据库中对序列结果进行Blast同源性比对。采用MEGA 7.0软件,通过Clustal W方法对分子鉴定结果进行序列分析,构建分子系统发育树[29]。

1.4 病原细菌对茶毒蛾的致病性测定

1.4.1 供试虫饲养 供试茶毒蛾幼虫采自福建省屏南县棠口乡安溪村茶园(26.969°N、118.972°E)。将采集的幼虫放入方形塑料盒(15 cm×10 cm×10 cm)中,置于温度(25±1) ℃、相对湿度70%、光周期(L∶D)14 h∶10 h的养虫室内,饲喂新鲜茶树嫩叶。

1.4.2 致病力测定 将Nan-Y菌株接种至NA平板培养基上,活化48 h后,用无菌水洗至无菌三角瓶(100 mL)中,SHA-C振荡器振荡10 min(150 r·min-1)。在无菌条件下,将菌悬液分别稀释10、102、103、104、105倍,取各浓度菌液1 μL,均匀涂布于NA固体培养基上。于28 ℃恒温培养箱倒置培养1 d后,将培养基平板上的菌落数乘以稀释倍数,取平均值,得到原液浓度。用无菌水将原液配制成(1.0±0.5)×1010、(1.0±0.5)×1011、(1.0±0.5)×1012、(1.0±0.5)×1013、(1.0±0.5)×1014cfu·mL-1共5种浓度的菌悬液。将新鲜茶树嫩叶浸泡于菌悬液中20 s后放入培养皿(D=15 cm)中,每个培养皿放入5片大小相对一致的叶片。选择大小基本一致的4龄健康茶毒蛾幼虫放入培养皿中饲喂,以浸无菌水的脱脂棉保湿,置于温度(25±1) ℃、相对湿度80%的人工气候箱内饲养。每种浓度为1个处理,每个处理5个重复,每个重复20头幼虫,以饲喂浸无菌水的茶树嫩叶为对照。每天定时观察、记录各处理幼虫的感染情况,轻触虫体不动视为死亡,以虫体软腐为有效致死。

1.5 数据处理与分析

用Excel 2016软件处理试验数据。用SPSS Statistics 22.0软件[30]对致死中时(LT50)和致死中浓度(LC50)进行Probit回归分析,并对死亡率进行Duncan′s新复极差法多重比较。

2 结果与分析

2.1 病原细菌的形态特征

经分离、纯化得到细菌Nan-Y。在NA培养基上33 ℃培养7 d后,菌落呈较小的淡黄色不规则点状,黏稠,表面微隆起,边缘较整齐(图1)。菌体杆状,分散排列,革兰氏染色呈红色,为革兰氏阴性菌(图2)。回接感染试验结果表明,茶毒蛾幼虫的感染症状与原始症状一致,从死亡虫体上分离、纯化的菌株的菌体、菌落特征与原菌株相同。由此可知,Nan-Y为茶毒蛾幼虫软腐病的病原细菌。

图1 Nan-Y菌株的菌落特征(33 ℃, 7 d)Fig.1 Colony characteristics of strain Nan-Y(33 ℃, 7 d)

2.2 16S rDNA分子鉴定结果

通过NCBI数据库进行Blast同源性比对,发现Nan-Y菌株的16S rDNA序列与不解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrumasacchrolyticum)菌株CCUG 46016(编号NR 042474.1)相应序列的一致性达99.71%。利用MEGA 7.0软件进行序列匹配排列,并构建系统发育树(图3),确定Nan-Y菌株为不解糖假苍白杆菌。

图3 菌株Nan-Y和假苍白杆菌属菌种的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain Nan-Y and Pseudochrobactrum sp.

2.3 Nan-Y菌株对茶毒蛾幼虫的致病性

2.3.1 茶毒蛾幼虫的感染症状与累计死亡动态 健康茶毒蛾4龄幼虫形态特征如图4A所示。取食浸泡过(1.0±0.5)×1012cfu·mL-1菌悬液的茶树嫩叶1 d后,部分茶毒蛾幼虫出现行动迟缓、痉挛、食欲减退、排软便等现象,有的甚至死亡。初死幼虫虫体失去光泽,软化,具脓状,之后体色逐渐加深至橙红色(图4B);死亡2 d后体色转为红棕色,体壁破裂流脓,伴有臭味;后期体色持续加深至黑褐色,虫体腐烂,内部组织溃烂、粘连;5 d后脓液流尽,仅余表皮(图4C)。

A.健康幼虫;B.感染初期;C.感染后期。

以不同浓度Nan-Y菌悬液处理2 d后,幼虫累计死亡率显著升高;处理6 d后,最低浓度[(1.0±0.5)×1010cfu·mL-1]处理下幼虫累计死亡率为61.00%,最高浓度[(1.0±0.5)×1014cfu·mL-1]处理下累计死亡率达100.00%(图5)。

图中不同大、小写字母分别表示经Duncan′s新复极差法检验,同一时间点不同处理间在0.01和0.05水平上差异显著。

2.3.2 Nan-Y对茶毒蛾幼虫的LT50茶毒蛾幼虫经不同浓度菌悬液处理后,死亡率差异较大。(1.0±0.5)×1014cfu·mL-1菌悬液处理3 d后,茶毒蛾幼虫的累计死亡率为68.00%,极显著高于其他浓度处理(P<0.01);(1.0±0.5)×1013、(1.0±0.5)×1014cfu·mL-1菌悬液处理6 d后,茶毒蛾幼虫的累计死亡率分别达96.00%和100.00%,极显著高于其他3种浓度处理(P<0.01),LT50也较短,分别为3.24、2.11 d;最低浓度 [(1.0±0.5)×1010cfu·mL-1]处理6 d后,茶毒蛾幼虫的累计死亡率为61.00%,LT50为5.47 d(表1)。可见,Nan-Y对茶毒蛾幼虫有较强的致病性。

表1 不同浓度Nan-Y菌悬液对茶毒蛾4龄幼虫的致死效果1)Table 1 Lethal effect of bacterial suspension of strain Nan-Y with different concentrations on E.pseudoconspersa 4th instar larvae

2.3.3 Nan-Y对茶毒蛾幼虫的LC50从表2可知,随着菌悬液浓度增大,茶毒蛾幼虫的死亡率不断升高。Nan-Y菌悬液处理茶毒蛾幼虫3、6 d的LC50分别为5.23×1013、3.04×109cfu·mL-1,LC90分别为9.21×1015、7.17×1012cfu·mL-1。

表2 不同浓度Nan-Y菌悬液在不同时间对茶毒蛾4龄幼虫的致死效果1)Table 2 Lethal effect of bacterial suspension of strain Nan-Y with different concentrations on E.pseudoconspersa 4th instar larvae at different time

3 讨论

目前,国内外有大量应用昆虫病原细菌防治害虫的成功案例。昆虫病原细菌可研发制成微生物制剂,其具有防效良好、不易产生“3R”问题等优点[31],在防治害虫方面起着重要作用。有关茶毒蛾病原细菌的研究已取得一定进展。例如:黄健屏等[32]用5株Bt菌株对茶毒蛾进行田间防治,发现喷洒1.0×108cfu·mL-1菌悬液7 d后,3龄幼虫死亡率为52.90%～99.10%,致死高峰在2～5 d;将1.0×108cfu·mL-1杀螟杆菌用于田间防治,茶毒蛾1、2龄幼虫的虫口减退率为84.10%[8];将16 000 IU·mg-1Bt可湿性粉剂稀释1 500倍用于防治茶毒蛾低龄幼虫,7 d后的防效为77.88%[25]。本试验从自然染菌的茶毒蛾病死虫体上分离得到一株病原细菌Nan-Y,为革兰氏阴性菌,菌体杆状,在33 ℃条件下于NA固体培养基上培养,其菌落较小,呈淡黄色不规则点状,黏稠,表面微隆起,边缘较整齐。经形态观察和分子鉴定,确定其为不解糖假苍白杆菌。经室内测定,Nan-Y对茶毒蛾幼虫有较强致病性,(1.0±0.5)×1013、(1.0±0.5)×1014cfu·mL-1菌悬液处理6 d后,茶毒蛾幼虫的校正死亡率分别达95.49%和100.00%。

不解糖假苍白杆菌属于假苍白杆菌属,为异养细菌,需氧,氧化酶反应阴性,接触酶反应弱阳性[33]。有关其对昆虫的致病性研究较罕见。Jiménez-corté et al[34]研究表明,不解糖假苍白杆菌对大蜡螟(Galleriamellonella)无致病性。目前,该菌主要用于治理重金属污染土壤[35-36],经发酵培养后还可作为催化剂提高对甲霜灵的回收率[37],且该菌对何首乌种子萌发有促进作用[38]。Robert et al[39]研究发现,不解糖假苍白杆菌对洋葱土传病原菌有生防潜力。本研究首次发现不解糖假苍白杆菌对茶毒蛾幼虫有较强的致病性。

病原细菌主要以3种方式侵入昆虫体内:自然孔口(如口腔、肛门、气门等)直接侵入、通过伤口间接侵入,以及通过线虫等媒介经昆虫口腔或伤口侵入[40-41]。病原细菌侵入寄主体内后,在其体内增殖,产生毒素、溶血素、蛋白酶、酯酶和对昆虫有毒害作用的次生代谢产物等,导致昆虫代谢体系紊乱,引发败血症,最终死亡[42-44]。但昆虫病原细菌细胞壁薄,易受温度、湿度和紫外光等环境因素的影响[45]。因此,有关不解糖假苍白杆菌Nan-Y对茶毒蛾的致病机理、致病条件、田间应用效果和安全性还需进一步研究。