基于UPLC法测定建昌帮姜制厚朴主成分含量变化差异*

涂爱国 孜拉来·吐尔洪 李 梅 叶喜德△

厚朴为木兰科植物厚朴(MagnoLiaofficinaLisRehd.et WiLs)或凹叶厚朴(MagnoLiaoffcinaLisRehd.et WiLs Rehd.et.WiLs)的干燥干皮、枝皮或根皮,主要分布于陕西、浙江、江西、甘肃、湖北、四川、贵州等地,其中四川、湖北、浙江为其主产地[1]。厚朴味苦、辛,归胃、脾、大肠、肺经,性温,具有行气、燥湿、消痰、消积、平喘之功效。厚朴经姜制后能够增强宽中和胃的能力,并可消除咽喉刺激感,常用治呕吐泻痢、脘腹胀满、痰饮喘咳、积滞便秘等证[2,3]。历代文献对厚朴的炮制方法均有记载,如汉代用去皮制法,唐代用姜汁制法。到了宋代,对厚朴姜制法有了更加详细的记载,提出“不以姜制,则棘人喉舌”之炮制理论,并创新性提出了新的炮制方法,如糯米粥制、生姜枣制等;明朝的姜汁炒制和煮制外,还采用酒制、煅制、姜蜜制和姜汁巴豆制等;清朝有醋炒记载[4]。现代常以姜汤煮、姜制、姜汁浸等法炮制,故现版《中华人民共和国药典》[1]中除了“厚朴”之外,也收载了“姜厚朴”。资料表明,厚朴主含木兰花碱、和厚朴酚、厚朴酚等有效成分[5]。因此,本研究以这3种成分为厚朴不同炮制品质量评价的指标,运用UPLC测定厚朴不同炮制品主要成分含量,目的是探讨不同炮制方法对其含量变化的影响,为深入研究厚朴炮制品变化及其作用机制提供数据支撑,也为优选其优质饮片提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器AcouityUPLCCLAss超高效液相、KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、二两装高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司)、XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)、TDL-80-2C低速离心机(上海安亭科学仪器厂)、药典筛(绍兴市上虞瑞志仪器厂)、十万分之一电子天平(现代中药制剂教育部重点实验室)、5 ml的一次性使用无菌注射器带针(圣光医用制品股份有限公司)、GZX-9076MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、SHZ-DIII循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2 试剂乙腈(纯度:色谱纯,安徽天地超纯溶剂有限公司)、超纯水(南昌哇哈哈食品有限公司)、甲醇(纯度:色谱纯,安徽天地超纯溶剂有限公司)、甲酸(批号:1101181,西陇科学股份有限公司)、甲醇(批号:B2210111,西陇科学股份有限公司)。

1.3 试药厚朴酚对照品(批号:MUST-21030614,纯度:99.90%,成都曼思特生物科技有限公司)、和厚朴酚对照品(批号MUST-21030111,纯度:99.37%,供含量测定用,成都曼思特生物科技有限公司)、木兰花碱对照品(批号:wkq-21022608,纯度:≥98%,四川省维克奇生物科技有限公司)。中药厚朴、生姜,均购于安徽惠仁堂中药饮片有限公司,两者经江西中医药大学中药鉴定室刘应姣副教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 厚朴炮制品的制备

2.1.1 厚朴生品取原药材,刮去粗皮,洗净,润透,切丝,晒干,备用。

2.1.2 姜制厚朴依照建昌帮制法:取原药材,用清水洗净灰屑,除去杂质,竖放入竹编内;再用湿抹布闷润,至内外湿润均匀时,刮去外表粗皮;将其切片晾干,置缸内;缸中加入定量姜汁(每100 kg厚朴,配12 kg生姜榨汁,掺水12 kg),拌匀后闷润1～2 d,取出晾至六成干,之后置于热锅内,文火炒至棕褐色约九成干时,取出厚朴,筛去灰屑,晾干即得,备用。

2.1.3 姜煮厚朴将生姜洗净切成片置于的锅中加适量清水,煮成姜汁,之后将厚朴置于姜汁中文火加热共煮,至锅中姜汁被厚朴将吸尽,取出厚朴晾凉,切细丝,晾干即得,备用。

2.2 供试品溶液的制备精密称取样品1粉末2.000 g,装入15 ml的EP管中,首次提取加入 50%甲醇水溶液5.5 ml,旋涡混合5 min,待溶剂被吸尽后,再加入适量50%甲醇溶液,常温下超声提取30 min,取出,置离心机中(3000 r/min),离心10 min,倾取上清液,置10 ml容量瓶中。连续反复提取3次(第2、3次添加溶剂量约3.5 ml),将3次提取液合并后,置10 ml容量瓶中定容。3种样品均以此法制备并冷藏保存。

2.3 对照品的制备精密称定木兰花碱、和厚朴酚、厚朴酚对照品适量,分别置于EP管内,各加入甲醇1 ml,超声5 min,摇匀,即可。

2.4 混合对照溶液的制备精密称取1.14 mg木兰花碱、1.15 mg厚朴酚、1.16 mg和厚朴酚对照品,共同置于10 ml容量瓶内,以甲醇溶液将3者溶解并定容。分别精密吸取120、120、500 μl的3种对照品混合储备液,将其置于离心管中,滴加甲醇溶液100 μl,制备成1.14、1.15、1.16 mg/ml的3种不同浓度的混合对照品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 色谱条件SyncronisC18UPLC-H色谱柱(Dim 150 mm×4.6 nm,5um),流动相乙腈(A)-0.1 %甲酸水(B)梯度洗脱(0～35 min,5%～45 %A;35～50 min,45 %～70 %A),流速0.3 ml/min,进样量2 μl,柱温40 ℃,在290 nm波长检测。见图1。

注:A:姜煮厚朴,B:姜制厚朴,C:生品厚朴,D:混合对照品;1:木兰花碱,2:和厚朴酚,3:厚朴酚。

2.5.2 线性关系的考察精密吸取混合对照品溶液1 ml,按“2.5.1”项下色谱条件对其进样分析,连续进样6次,进样量为0.5～3 μl,设横坐标为进样浓度(μg/ml),纵坐标为峰面积,得线性回归方程和标准曲线。见表1。

表1 线性关系考察结果

2.5.3 精密度考察精密吸取对照品混合溶液1 ml,相同测定条件下,连续进样6次,记录峰面积。结果得精密度RSD分别为0.818%(木兰花碱)、0.496%(厚朴酚)、0.493%(和厚朴酚),三者均小于3%,表明该仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性考察取厚朴生品供试品溶液,分别于配制后0、2、4、8、12、24 h按“2.5.1”项下色谱方法,并测定其峰面积,计算RSD值。结果显示,三者峰面积变化不大,RSD值分别为1.455%(木兰花)、1.230%(厚朴酚)、2.027%(和厚朴酚),均小于3%,表明样品在24 h内稳定性良好。

2.5.5 重复性考察精密称取同一供试品6份,按“2.5.1”项下色谱方法测定峰面积,计算RSD值。三者标准差分别为627.34(木兰花碱)、7147.57(和厚朴酚)、48662.03(厚朴酚)。RSD分别为2.938%(木兰花碱)、2.377%(和厚朴酚)、2.302%(厚朴酚),三者均小于3%,表明本法重复性良好。

2.5.6 加样回收率考察称取生品厚朴供试品适量,精密称定,加入1.14 mg木兰花碱、1.15 mg厚朴酚、1.16 mg和厚朴酚的混合对照品适量,按2.3项下的条件制备供试品溶液,按2.5.1项下的色谱条件进样测定,计算加样回收率。见表2。

表2 加样回收率考察结果

2.5.7 样品的含量测定精密取各种厚朴制剂(不同批次),各取3份,并精密称定每份约1.000 g,依据“2.3”项的方法制备供试品溶液,照“2.5.1”项色谱方法进行测定,并计算3种主要化学物质的百分含量。见表3。

表3 厚朴样品中3种成分的含量测定 (%)

3 讨论

厚朴的炮制有炒制、盐炒、煮制、酥制、醋制、酒浸炒、姜汁浸后炒干等,现代炮制方法多为姜汤煮、姜制、姜汁浸等。目前《中华人民共和国药典》[1]收载了“姜厚朴”,而厚朴姜制法也是江西建昌帮特色炮制法,其使用辅料和炮制方法与《中华人民共和国药典》[1]所载的姜厚朴制法有明显差异。为此,以建昌帮特色炮制法做的姜厚朴为研究对象,并与其他厚朴炮制品进行有效成分比较,以厚朴主要成分木兰花碱、厚朴酚、和厚朴酚为质量评价指标,探讨不同炮制方法对厚朴主要有效成分含量变化的影响,为建昌帮姜厚朴中药饮片炮制的合理性提供科学依据。

本研究选择木兰花碱、厚朴酚、和厚朴酚为厚朴不同炮制品的成分变化指标。其主要依据是这些具有明显的生物活性。药效研究证实,厚朴酚、和厚朴酚均具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用,并具抗抑郁、抗癫痫、抗脑缺血、抗痴呆等多种作用[6,7]。此外,厚朴酚还可改善胃肠运动障碍,和厚朴酚具有保肝功能;而木兰花碱作为一种存在于厚朴中的重要生物碱,同厚朴酚以及和厚朴酚一样,具有抗炎、抗氧化作用,并具有抗心律失常和降压等活性作用[8-10]。

本研究结果表明,姜制厚朴,与其他厚朴炮制品所含木兰花碱、厚朴酚、和厚朴酚的含量分别为:生品厚朴(10.87%、11.06%、8.83%)、姜制厚朴(10.78%、8.14%、5.95%)、姜煮厚朴(11.03%、7.87%、3.13%)。说明炮制对其成分含量产生影响。与生品相比,建昌帮姜厚朴中厚朴酚、和厚朴酚等成分含量明显降低,姜煮厚朴的厚朴酚、和厚朴酚含量最低,说明辅料姜和加热等因素会影响厚朴酚、和厚朴酚的溶出,其中姜煮对厚朴的影响明显更高。

综上,不同炮制方法对厚朴主要有效成分含量产生的影响不同,其中影响最大者为木兰花碱,其次是厚朴酚、和厚朴酚。在含量变化方面,厚朴经过姜制,厚朴酚以及和厚朴酚都有一定程度的降低,姜煮厚朴下降更明显,而木兰花碱炮制前后含量变化不显著。望此结果为今后厚朴的药物研究提供参考。