中药炮制辅料炼蜜制备工艺及质量标准研究*

刘小鸣,曹文文,王瑞生,3,张振凌,3

1.河南中医药大学第三附属医院,河南 郑州 450008; 2.河南中医药大学,河南 郑州 450046;3.河南省中药特色炮制技术工程研究中心,河南 郑州 450008

蜂蜜又称“岩蜜”“石饴”,始载于《神农本草经》:“石蜜……主心腹邪气,诸惊痫庢,安五脏,诸不足,益气补中,止痛解毒,除众病,和百药。久服,强志轻身,不饥不老[1]。”《中华人民共和国药典》记载:蜂蜜,甘,平。归肺、脾、大肠经。补中,润燥,止痛,解毒。外用生肌敛疮,外治疮疡不敛、水火烫伤;用于脘腹虚痛、肺燥干咳、肠燥便秘,解乌头类药毒[2]。蜂蜜作为辅料与药物共制时需炼制,即炼蜜,其与药物具有协同作用,发挥增强药物疗效、解毒、缓和药物性能、矫味矫臭等作用[3-5]。陶弘景《本草经集注》云:“凡蜜,皆先上火煎,掠去其沫,令色微黄,则丸经久不坏,掠之多少,随蜜精粗[6]。”李时珍《本草纲目》曰:“凡炼沙蜜,每斤入水四两,银石器内,以桑柴火慢炼,掠去浮沫,至滴水成珠不散,乃用,谓之水火炼法。”因此,炼蜜的方法为:银石器加约四分之一水,掠去杂质,炼制至“色微黄”或“滴水成珠”。古代炼蜜多采用敞口容器直火加热的方式,炼蜜质量常依据操作者的经验判断。现代炼蜜采用夹层蒸汽锅,能够控制炼制温度和时间,确保炼蜜受热均匀。

文献调研发现,常有学者将炮制辅料炼蜜与中药制剂炼蜜混淆。传统制剂炼蜜根据水分、密度和炼制温度,分为“嫩蜜”“中蜜”和“老蜜”,但炮制辅料炼蜜没有明确区分。目前,各省市炮制辅料炼蜜的炮制工艺差异较大,有以滴水成珠为度者,有以用棒挑起绵绵不断为度者,有以用手捻之拉黄丝为度者,有以炼至红黄色小金泡为度者[7-8]。正如《江西省中药饮片炮制规范》(2023年版)的炼蜜炮制方法为:取原药材,加热,趁热过滤,去杂质及泡沫,置锅内熬至起“米筛花”泡状,呈黄棕色,能“滴水成珠”为度[9]。《安徽省中药饮片炮制规范》(2019年版)的炼蜜炮制方法为:取净蜂蜜,置锅内,文火熬炼至黄棕色,滴水成珠[10]。《河南省中药饮片炮制规范》(2022年版)的炼蜜炮制方法为:取净蜂蜜置适宜容器内,用文火熬炼,滤去沫,炼至“搭丝”,取出,放凉。取滤过的蜂蜜加3%～5%水,蜜温90～96 ℃炼制8～10 min[11]。因此,本研究基于既往文献,设计正交试验,旨在优化炮制辅料炼蜜的制备工艺,并为炼蜜质量标准的制订提供依据。

1 材料

1.1 药物与试剂生蜂蜜(河南省许昌市鄢陵县某蜂厂,批号:20200107),质量符合《中华人民共和国药典》(2020年版)质量要求;D-葡萄糖、果糖、D-无水葡萄糖(成都普思生物科技股份有限公司,纯度>96%,批号:PS010303、PS160708-11、PS160816-08);碘(成都市科隆化学品有限公司,批号:20180922);碘化钾(青岛金海碘化有限公司,批号:20200520);乙酸铵、可溶性淀粉(天津市登科化学试剂有限公司,批号:20180406、20180512);酚酞(西安化学试剂厂,批号:20180720);氢氧化钠(天津市风船化学试剂科技有限公司,批号:20191105);甲醇、乙醇(分析纯,天津市富宇精细化工有限公司,批号:20210408、20210316);磷酸(色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司,批号:20151025);甲醇、乙腈(色谱纯,安徽天地高纯溶剂有限公司,批号:20201018、20201116);浓硫酸、浓盐酸、浓氨水(烟台市双双化工有限公司,批号:20160608、20151018、20150526);苯酚(上海麦克林生物科技有限公司,批号:20161115);溴代萘(上海彼爱姆光学仪器制造有限公司,批号:20201025)。

1.2 仪器UV-3200S型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);Waters 1525-2489高效液相色谱仪(美国Waters公司);UM5000蒸发光散射检测器(上海通微分析技术有限公司);Prevail Carbohyrate ES色谱柱(美国Alltech公司);HH-S6型数显恒温水浴锅(常州市华普达教学仪器有限公司);LX3611箱式高温电阻炉(天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司);BT25S型十万分之一天平、BSA224S-CW型万分之一天平(赛多利斯科技仪器有限公司);KQ-500DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);DTC-22B型真空泵(日本爱发科株式会社);UPT-Ⅱ-10T型优普系列超纯水器(成都超纯科技有限公司);BT1000L型蠕动泵(保定雷弗流体科技有限公司);BM-2W型阿贝折射仪(上海彼爱姆光学仪器制造有限公司);Agilent 1260 Infinity Ⅱ Prime液相色谱仪、InfinityLab Poroshell 120 ES-C18色谱柱(德国Agilent公司,3.0 mm×150.0 mm,2.7 μL);DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);1174B摇摆式四两装高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司)。

2 方法

2.1 炼蜜制备工艺研究查阅文献发现,不同地市中药饮片炮制规范中炮制辅料炼蜜的炼制工艺有较大差异,炼制温度有70～90 ℃,也有110 ℃以上。通过前期的预实验,以保持微沸至出现淡黄色“鱼眼泡”为标准,采用单因素考察,优选加热温度为 80 ℃,加热时间为8 min,每100 g生蜂蜜加水5 g。在单因素考察结果的基础上设计正交试验,优选最佳炼蜜制备工艺。

2.1.1 正交试验设计将加热温度、加热时间、加水量作为考察因素,采用L9(34)设计正交试验,A代表加热温度,设置为70 ℃、80 ℃、90 ℃;B代表加热时间,设置为6 min、8 min、10 min;C代表每100 g蜂蜜的加水质量,设置为3 g、5 g、8 g;制备9批炼蜜样品,实验设计见表1、表2。

表1 正交因素水平表

表2 正交试验表

2.1.2 水分含量测定方法取9批炼蜜样品1～2滴,分别滴于棱镜上,棱镜预先连接阿贝折光计与恒温水浴锅,水浴温度为(40.0±0.1)℃;用标准物品校正折光计的折光指数,并根据折光指数计算样品中的水分含量[12-15]。

水分含量={100-[78+390.7(n-1.476 8)]}×100%(n为折光指数)。

2.1.3 总糖含量测定方法

2.1.3.1 标准曲线制作准确称取D-无水葡萄糖6.00 mg于150 mL容量瓶中,加蒸馏水溶解后定容,制成标准溶液;分别抽取0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL标准溶液,均以蒸馏水补足至2.0 mL,制成标准稀释液,并按顺序编号;分别加入6%苯酚溶液1.0 mL、浓硫酸5.0 mL,摇匀,冷却,制成标准待测液;常温放置30 min,用紫外分光光度计在490 nm波长下测定标准待测液的吸光度。以2.0 mL蒸馏水作为标准稀释液的对照,经过相同的显色操作后作为空白组。以标准稀释液浓度为横坐标、标准待测液吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

2.1.3.2 总糖含量测定精密称量炼蜜样品0.1 g于100 mL容量瓶中,加蒸馏水溶解后定容,制成样品液;取样品液0.2 mL,加蒸馏水4.8 mL,制成样品稀释液;取样品稀释液2.0 mL,加入6%苯酚溶液1.0 mL、浓硫酸5 mL,摇匀,冷却,制成样品待测液;常温放置30 min,用紫外分光光度计在490 nm波长下测定样品待测液的吸光度[16];以蒸馏水同法显色为空白对照,代入回归方程后计算总糖含量。

2.1.4 最佳炼蜜制备工艺筛选以9批炼蜜样品中的水分含量、总糖含量为检测指标,分别赋予权重0.3、0.7,计算水分含量隶属度、总糖含量隶属度以及综合评分,综合评分数值最大者即为最佳制备工艺[17-19]。

水分含量隶属度=(最大值-变量值)/(最大值-最小值);

总糖含量隶属度=(变量值-最小值)/(最大值-最小值);

综合评分=水分含量权重×水分含量隶属度+总糖含量权重×总糖含量隶属度。

2.2 炼蜜质量标准研究

2.2.1 样品制备根据“2.1.4”实验结果优选最佳炼蜜制备工艺,制备10批炼蜜样品,依次编号为 Y1-Y10。

2.2.2 性状鉴别参照各省市中药饮片炮制规范、标准,运用感官(眼看、鼻嗅、口尝、手摸等)对10批炼蜜样品的形状、颜色、质地、气味、滋味等逐一鉴别,从而总结炼蜜样品的性状特征。

2.2.3 酸度、成分、密度测定方法

2.2.3.1 酸度测定取炼蜜样品10 g,加入新沸过的冷水50 mL,混匀,加酚酞指示液2滴与氢氧化钠滴定液(0.1 mol·L-1)4 mL,观察样品的颜色变化[20]。

2.2.3.2 淀粉、糊精测定取炼蜜样品2 g,加水10 mL,加热煮沸,冷却,加碘溶液1滴,观察样品的颜色变化[21]。

2.2.3.3 水分含量测定同“2.1.2”项方法。

2.2.3.4 灰分含量测定取大小适宜的瓷坩埚置马弗炉中,在550 ℃下灼烧30 min,冷却至200 ℃以下后取出,放入干燥器中冷却至室温,准确称量,并重复灼烧至恒量。用坩埚称量约3.000 0 g蜂蜜后,将坩埚放入马弗炉中,小火加热,使蜂蜜充分炭化至无烟。然后在550 ℃下灼烧4 h,冷却至200 ℃以下,取出,放入干燥器中冷却30 min,准确称量;重复灼烧2次,根据第3次灼烧后质量计算灰分含量[22-24]。

灰分含量=m(总灰分)/m(样品)×100%,其中m(总灰分)=m(灰化后)-m(恒重坩埚)

2.2.3.5 相对密度测定取洁净、干燥并精密称定质量的比重瓶,装满炼蜜样品(温度低于20 ℃)后,插入中心有毛细孔的瓶塞,用滤纸除去从塞孔溢出的液体;置20 ℃恒温水浴中,随时用滤纸将瓶塞顶端擦干;待液体不再由塞孔溢出,迅即将比重瓶自水浴中取出,用滤纸将比重瓶外面擦净并精密称定,减去比重瓶的质量即为样品质量;将样品倾去,洗净比重瓶,装满新沸过的冷水,再照上法测得同一温度时水的质量。

相对密度=样品质量/水的质量[25]

2.2.4 果糖、D-葡萄糖含量测定方法

2.2.4.1 色谱条件以Prevail Carbohyrate ES(250.0 mm × 4.6 mm,5 μm)为色谱柱;流动相:乙腈-水(7030);流速:1 mL·min-1;柱温:40 ℃;检测波长:254 nm。UM5000蒸发光检测器,载气:氮气;流速:2 mL·min-1;漂移管温度:90 ℃;进样量:10 μL。理论塔板数按果糖峰计算应不低于 2 000。

2.2.4.2 供试品溶液制备精密称取炼蜜样品0.3 g,蒸馏水稀释,转移至25 mL容量瓶,加水定容,过滤,取滤液,即得供试品溶液。

2.2.4.3 对照品溶液制备精密称取果糖 21.76 mg、D-葡萄糖27.81 mg,分别加双蒸水溶解,转移至5 mL容量瓶,定容,过滤,取滤液,即得果糖对照品溶液和D-葡萄糖对照品溶液[26]。

2.2.4.4 方法学考察

2.2.4.4.1 线性关系考察取果糖对照品溶液 8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL,取D-葡萄糖对照品溶液4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL,分别注入液相色谱仪,测量对照品溶液质量和峰面积值。以对照品溶液质量为横坐标,峰面积值为纵坐标,绘制标准曲线,计算线性回归方程。

2.2.4.4.2 精密度实验取果糖对照品溶液、D-葡萄糖对照品溶液,分别进样10 μL,重复进样6次,测定峰面积并计算相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

2.2.4.4.3 稳定性实验选取Y1号炼蜜样品,按照“2.2.4.2”项方法制备供试品溶液,分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h进样,测定果糖、D-葡萄糖的峰面积并计算RSD。

2.2.4.4.4 重复性实验选取Y1号炼蜜样品6份,按照“2.2.4.2”项方法制备供试品溶液,测定果糖、D-葡萄糖的峰面积并计算RSD。

2.2.4.4.5 加样回收实验取炼蜜样品6份,每份约0.1 g,分别精密加入1 mL果糖对照品溶液(42.15 g·L-1)、1 mL D-葡萄糖对照品溶液(32.50 g·L-1),按照“2.2.4.2”项方法进行操作,然后测量果糖、D-葡萄糖含量,并计算加样回收率RSD。

2.2.4.5 果糖、D-葡萄糖含量测定按照“2.2.4.2”项方法制备Y1-Y10炼蜜样品供试品溶液,进样10 μL,测量峰面积,代入线性回归方程,计算果糖和D-葡萄糖含量。

3 结果

3.1 炼蜜制备工艺

3.1.1 标准曲线D-无水葡萄糖标准曲线的回归方程是y=0.019 7x-0.031 7,R2=0.999 6;总糖浓度在8～36 mg·L-1范围内的线性关系良好,见图1。

图1 标准曲线图

3.1.2 最佳炼蜜制备工艺正交试验结果表明,最佳炼蜜制备工艺组合为:A3B3C2,即加热温度为90 ℃,加热时间为10 min,每100 g生蜂蜜加水5 g,见表3。

表3 正交试验结果

3.2 炼蜜质量标准

3.2.1 性状鉴别结果炼蜜样品为半透明、带光泽、浓稠的液体,呈浅黄色,无结晶;气芳香,味极甜。

3.2.2 酸度、成分、密度测定结果

3.2.2.1 酸度炼蜜样品均呈粉红色且10 s内不褪去,说明样品保存较好,没有发酵变酸。

3.2.2.2 淀粉、糊精炼蜜样品均不显蓝色、绿色或红褐色,说明样品中没有掺入淀粉或糊精。

3.2.2.3 水分、灰分、相对密度炼蜜水分含量为16.217 6%～17.819 5%,灰分含量为0.052 3%～0.087 0%,相对密度为1.463 6～1.466 0。根据测定结果,建议炼蜜水分含量不得过24%,灰分不得过0.2%,相对密度不低于1.349,见表4。

表4 水分含量、灰分含量、相对密度测定结果

3.2.3 果糖和D-葡萄糖含量测定结果

3.2.3.1 方法学考察

3.2.3.1.1 线性关系考察果糖对照品的线性回归方程是y=208 299.023 4x-1643 097.400 00,R2=0.999 3,果糖对照品在34.816～69.630 μg质量范围内的线性关系良好,见表5、图2;D-葡萄糖对照品的线性回归方程是y=231 659.268 2x-2 141 443.200 0,R2=0.999 4,D-葡萄糖对照品在22.248～66.744 μg质量范围内的线性关系良好,见表6、图3。

图2 果糖线性回归图

图3 D-葡萄糖线性回归图

表5 果糖线性关系考察结果

表6 D-葡萄糖线性关系考察结果

3.2.3.1.2 精密度实验果糖对照品、D-葡萄糖对照品的峰面积RSD分别为1.3%、1.9%,表明仪器精密度良好。

3.2.3.1.3 稳定性实验Y1炼蜜样品在不同时间果糖、D-葡萄糖的峰面积RSD分别为2.5%、3.0%,表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

3.2.3.1.4 重复性实验6份Y1炼蜜样品中果糖、D-葡萄糖的峰面积RSD分别为1.1%、0.8%,表明该方法重复性良好。

3.2.3.1.5 加样回收实验炼蜜样品中果糖的平均加样回收率为98.97%,RSD为1.8%;D-葡萄糖的平均加样回收率为97.27%,RSD为1.8%,表明加样回收率良好,该方法准确可靠。

3.2.3.2 果糖、D-葡萄糖含量炼蜜样品中果糖和D-葡萄糖含量总和为74.187 9%～75.578 5%,平均值为74.945 3%;果糖含量/D-葡萄糖含量比值为1.26～1.31,平均比值为1.29。因此,建议炼蜜的果糖、D-葡萄糖含量总和不少于60%,果糖含量/D-葡萄糖含量比值不小于1,见表7。

表7 果糖、D-葡萄糖含量测定结果

4 讨论

研究发现,蜂蜜主要由果糖、葡萄糖、蔗糖和水分等组成。其中,果糖和葡萄糖约占其总量的 65%～80%,蔗糖含量约占5%。此外,蜂蜜中含有多种酶类、维生素、氨基酸和有机酸等。常见的蜂蜜品种包括槐花蜜、枣花蜜、椴树蜜、荆条蜜以及油菜蜜等。顾雪竹等[27]指出蜂蜜具有润肠、护肝、护心、抗菌、抗炎等作用,同时列举蜂蜜在肠道、肝脏、心脏、神经系统、外伤感染等方面的应用。蒋多亮等[28]总结蜂蜜在创伤、小儿痱子、口腔溃疡、消化性溃疡、便秘、肛肠疾病、咳嗽、干燥性鼻炎、静脉炎、角膜炎、角膜溃疡等疾病中的应用,显示出蜂蜜具有广泛的药理作用。

蜂蜜不仅单独作为药用成分,也是中药炮制中不可或缺的辅料。在中药制备过程中,蜂蜜经常与其他药物共制,以实现协同增效的目的。例如,经过蜜炙的麻黄、白前、款冬花、紫菀、百部、旋覆花、枇杷叶等中药,其润肺止咳功效显著提升,故有“蜜炙甘缓而润肺”之说。蜂蜜作为中药炮制辅料,在使用前必须经过严格的炼制过程。《中华人民共和国药典》(2020版)规定,制作蜜炙中药饮片时须用炼蜜,并且应在加入适量水稀释后使用,但药典并未规定炼蜜的具体方法、炼制程度及质量标准。基于此,本研究优化炮制辅料炼蜜的制备工艺,鉴别其性状,检查其酸度、淀粉和糊精情况,测定其水分、灰分含量和相对密度,采用高效液相色谱法测定果糖、D-葡萄糖含量,从而为炼蜜质量标准的制订提供依据。