中药调控RhoA信号通路防治糖尿病肾病研究进展*

陈影,刘玲玉,刘浩飞,冯睿,苗少博,马继伟,

1.河南中医药大学第一临床医学院,河南 郑州 450000; 2.河南中医药大学第一附属医院肾病科二病区,河南 郑州 450000

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是以持续性蛋白尿为主要特征的一组临床综合征[1],是糖尿病(diabetes mellitus,DM)常见的微血管并发症,其早期病理特征表现为肾小球基底膜增厚,系膜的扩张、肾小管细胞和足细胞受损;晚期形成弥漫性/结节性的肾小球硬化以及肾间质的纤维化[2-3]。流行病学调查研究显示,DN的发病率迅速上升,约30%～40%的糖尿病患者会发生DN[4],已经成为终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)的主要病因[5-7]。通常认为DN是多种基因相互作用,病因复杂,其发挥作用的分子机制尚未明确[8]。目前治疗DN的药物主要有免疫抑制剂、单抗类靶向药RAAS抑制剂、SGLT2抑制剂等,但只能适当改善水肿、乏力、泡沫尿和蛋白尿等临床症状,尚不能阻止疾病进展,且药物具有较大毒副作用及不良反应,加之患者个体差异,尚不能满足临床需求[9]。研究发现,中药及中药复方具有多途径、多靶点、作用温和、毒副作用小的特点,在防治DN中疗效突出[10]。从信号通路探究药物对DN的调控机制及作用靶点已成为当今研究热点,DN的发病与多条信号通路的异常传导息息相关,而RhoA信号通路作为细胞内关键的信号转导通路之一,能够抗氧化应激、抗炎、抑制肾脏纤维化、维持内皮细胞功能和保护足细胞等,在DN的发生发展中具有重要作用[11]。基于此,本文通过梳理RhoA信号通路在DN中的作用机制,首次综述中药、中药活性成分及中药复方的干预作用,以期为DN的中医药治疗和新药研发提供理论依据。

1 RhoA信号通路

RhoA信号通路是一种调控细胞生长、凋亡、增殖及血小板聚集、细胞黏附、接触抑制的信号轴,在多种生物活动中发挥重要作用[12]。RhoA是小的GTP结合蛋白,在细胞活动中发挥作用,参与维持细胞形态、调节细胞骨架、细胞迁移、平滑肌细胞收缩等。RhoA GTP酶和下游的Rho激酶(Rho-associated coiled-coil-forming kinases,ROCK)激活,诱导肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)磷酸化,从而维持内皮细胞屏障的完整性[13]。MLC的磷酸化又进一步有助于F-肌动蛋白细胞骨架的收缩和内皮细胞之间的细胞间隙,从而增加肾小球滤过屏障(glomerular filtration barrier,GFB)的通透性,RhoA/ROCK的激活参与了肾小球白蛋白的高滤过和高血糖引起的微血管/视网膜并发症。高糖激活RhoA/ROCK通路,导致MLC的磷酸化增加,肌动蛋白应激纤维形成,导致内皮通透性增加[14]。

2 中医药治疗DN的优势

DN属于中医学上的“水肿”“尿浊”“膏淋”“关格”“消渴”“水病”[15]等范畴。医史典籍中对消渴日久转变成水肿和尿浊早有论述。隋代巢元方《诸病源候论》载:“消渴其久病变,或发痈疽,或成水疾[16]。”病因病机的研究方面,国医大师吕仁和提出“微型癥瘕”,提供一种新的治疗思路[17]。朱政洁等[18]认为DN的病机是本虚标实、脾肾亏虚,虚实夹杂为发病的主要基础,其进展的重要因素是痰瘀内阻,内外风邪相加,治疗应以益气养阴和补肾活血为本,重视温阳和祛风。王耀献提出了“辨机论治”[19]和“内热致癥”的思想,治疗过程中重在引邪透邪,截断疾病入里的趋势[20],临床上能显著改善症状,控制血糖和蛋白尿[21]。目前,临床汤药集中在当归补血汤、五苓散、猪苓汤、六味地黄丸等,中医外治疗法包含针灸、穴位贴敷、中药保留灌肠等[22],中医药可以显著改善临床有效率,减少尿蛋白,改善乏力、水肿的临床症状,推迟进入终末期肾脏病和开始透析时间,降低全因死亡率,改善患者的长期预后[23-24]。在一项荆防当归补血汤治疗DN的临床观察中,与单用西药相比,中药联合西药能够明显减轻患者早期临床症状,降低血清中miR-148b-3p、miRNA-21的水平,抑制氧化应激,减轻足细胞损伤,改善肾功能,疗效显著[25]。郭帅等[26]经多中心、随机对照试验表明,益气养阴消癥通络方联合西药治疗Ⅲ、Ⅳ期DN,可有效改善患者临床症状,降低蛋白尿,保护肾功能,提高患者生活质量,诸多研究都彰显了中医药治疗的优势。

3 RhoA与DN的关系

3.1 RhoA与氧化应激氧化应激是氧化剂和抗氧化剂平衡紊乱的反应过程。在内外环境作用下,体内产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)和氮自由基,抗氧化防御系统不能完全清除,机体内ROS生成增多,而抗氧化应激能力下降,在细胞和组织中产生一系列生理和病理反应过程[27]。氧化应激是DN发病的核心机制之一,糖尿病可以增强氧化应激的活性,过度氧化应激又可以导致糖尿病并发症发生,直接导致肾间质、肾小球和肾脏足细胞的损伤[28]。RhoA和氧化应激关系密切,氧化应激可以通过多种途径激活RhoA,并且调节其活性;而RhoA信号通路又参与到调节细胞对氧化应激的应答,具体表现在以下3方面:(1)RhoA在氧化应激中的作用:RhoA的活化可以调节细胞骨架的重塑、细胞黏附以及迁移的过程,并且参与到调控细胞对氧化应激的应答。RhoA信号通路的激活可通过调节多个下游效应蛋白如ROCK,参与氧化应激引发的炎症反应和损伤修复的过程。(2)活性氧物种调控RhoA信号:活性氧物种,如过氧化氢和超氧阴离子可以直接调节RhoA,进一步促进其下游信号通路的激活。(3)抗氧化剂调控RhoA:某些抗氧化剂如N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽等可通过减少氧化应激和清除活性氧的物种,抑制RhoA信号通路的活化,表明控制氧化应激的水平可以调节RhoA信号通路的活性[29]。总之,RhoA信号通路和氧化应激相互影响和调节,氧化应激可以激活RhoA,而RhoA的激活又参与到调控细胞对氧化应激的应答。

3.2 RhoA与炎症反应炎症反应是导致DN的关键因素,虽然适当的炎症可以维持组织完整性和稳态,但是过度的炎症加速ECM的沉积,加重肾组织损伤[30-31]。RhoA与炎症反应关系密切,可以从多个机制参与调控炎症反应:(1)细胞迁移:一方面,RhoA可以调节细胞运动和细胞迁移,如巨噬细胞和中性粒细胞。另一方面,RhoA可通过激活ROCK和下游的其他效应蛋白,进而调节细胞骨架的重塑,使细胞产生收缩和变形,促进细胞的迁移。(2)炎症介质的释放:炎症细胞一旦受到刺激会产生大量炎症介质,如化学介质和细胞因子等。RhoA通过调控细胞骨架以及内质网重塑,影响炎症介质的合成和释放。(3)细胞和细胞之间相互作用:RhoA通过调节细胞和细胞外基质相互作用,影响炎症细胞和内皮细胞的黏附迁移,参与到炎症反应的浸润中[32]。

3.3 RhoA与肾脏纤维化肾脏纤维化是一种病理过程,其特征是肾脏组织中的瘢痕和纤维化区域的增加,导致正常的肾小球和肾单位结构受损[33]。RhoA的激活可导致细胞内信号通路的异常激活,进而促进肾小球内皮细胞和间质细胞的增殖、迁移和分泌胶原等纤维化相关分子。这些变化最终导致肾脏组织的结构紊乱和纤维化病变[34]。具体表现在以下两个方面:(1)RhoA通过激活下游信号通路,如Rho激酶和Rho关联蛋白激酶(ROCK),参与调节肾脏纤维化过程中的各种生物学效应,包括增强肾小管上皮细胞的收缩,促进成纤维细胞的增殖和胶原基质的合成,引导肾小球内皮细胞的迁移以及破坏肾小球滤过屏障等。ROCK活性增强又可以进一步促进肾小球内皮细胞和间质细胞转化为肌成纤维细胞,刺激基质的合成和沉积,最终导致肾脏纤维化[35]。(2)RhoA直接调节促纤维化基因的表达,通过调节促纤维化信号通路的激活,进一步调节细胞外基质的产生。研究表明,选择性ROCK2抑制剂KD025能减轻db/db小鼠的蛋白尿和肾小球的纤维化[36]。

3.4 RhoA与内皮功能障碍内皮功能障碍是由多种途径导致的,晚期糖基化终产物(advanced glycation end product,AGEs)是葡萄糖与蛋白质、脂质或核酸大分子之间非酶糖基化反应的产物,长期高糖环境下,大量的AGEs在肾脏中积累,导致内皮细胞损伤,并且改变形态和细胞骨架,内皮损伤是肾小球系膜病变及肾小球硬化的始动因素[14],蛋白尿就是DN中肾小球内皮细胞广泛损害的标志之一。DN的蛋白尿发病机制复杂,涉及GFB功能障碍,人肾小球内皮细胞与足细胞相互作用,有助于GFB的完整性。RhoA信号通路和内皮细胞功能障碍关系密切,MLC的磷酸化和F-肌动蛋白应激纤维的形成是内皮高通透性的关键因素[37-38]。HG激活RhoA/ROCK信号通路,导致MLC磷酸化增加,肌动蛋白应激纤维形成,导致内皮细胞通透性增加。RhoA GTP酶和下游ROCK的激活,诱导MLC的磷酸化[37],在维持内皮细胞屏障的完整性方面发挥重要作用[39]。

3.5 RhoA与足细胞损伤足细胞排列在肾小球基底膜外表面,是肾小球滤过屏障的重要组成部分,与内皮细胞和肾小球基底膜共同调节肾小球滤过功能。DN是由于足细胞凋亡增加,导致肾小球滤过功能减弱,进而出现蛋白[40]。足细胞损伤后,RhoA信号通路的激活导致RhoA蛋白转换为活性GTP结合形式,调控其下游效应蛋白ROCK蛋白激酶,进一步调控细胞骨架重构和细胞功能改变。下游蛋白ROCK被激活,磷酸化肌球蛋白轻链,促进肌动蛋白收缩和细胞骨架重塑,有利于足细胞损伤的修复和重新连接[41]。综上所述,RhoA信号通路在足细胞损伤的修复过程中发挥着重要调节作用,通过调控细胞骨架的重组、肌动蛋白的收缩以及细胞迁移和增殖等过程,帮助维持足细胞的正常功能和组织结构。

4 中医药通过RhoA信号通路对DN的干预作用

4.1 中药单体对RhoA信号通路的影响

4.1.1 水蛭素水蛭素是中药水蛭的有效成分,具有抗凝、抗血栓、抗纤维化、抗肿瘤、减轻脑损伤和提高随意皮瓣成活率的作用,能够减少钙离子内流,保护足细胞,减少RhoA蛋白,保护足细胞骨架[42]。研究发现,水蛭素能够减轻db/db小鼠的蛋白尿和肾功能,同时维持高糖诱导的相关蛋白的表达水平,修复足细胞F-actin,与RhoA信号调节足细胞骨架相关[43]。水蛭素还可以阻断RhoA/p38/NF-κB信号通路,抑制血管生成因子的表达,从而抑制肾小球内皮细胞的迁移和血管生成[44]。

4.1.2 柚皮素柚皮素是一种从柑橘类植物中提取出来的黄酮类化合物,主要作用是抗心律失常、抗炎、抗纤维化以及抗肿瘤和病毒等[45]。有研究表明,经柚皮素和ROCK的抑制剂法舒地尔干预后,肾脏组织中RhoA、ROCK1、ROCK2 的表达下降,MYPT1 Thr853 磷酸化程度也减低,ROCK活性减弱,并且伴有蛋白尿的减少和肾功能的改善[46-47]。

4.1.3 雷公藤多苷雷公藤多苷是中药雷公藤的有效成分,可以直接作用于抗原抗体复合物,发挥抗氧化、抗炎、免疫抑制、抗增殖和抗癌的作用[48]。保护肾功能主要是通过提高系膜细胞代谢速度,避免分泌血管内皮生长因子。研究表明,雷公藤多苷治疗DN,主要是通过上调足细胞 nephrin、podocin表达,保护和及时修复足细胞以达到减轻蛋白尿的目的。此外,对DN大鼠的血清总胆固醇、三酰甘油和空腹血糖都有明显的改善作用,可能与2型糖尿病的胰腺细胞以及血管内皮功能障碍与ROCKs的活性密切相关[49]。

4.1.4 梓醇梓醇是地黄代表性的效应单体,发挥着抗细胞凋亡、抗氧化应激和抗高血糖的作用。梓醇能显著减少肾内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1、抑制巨噬细胞迁移和炎性因子分泌,调节巨噬细胞M1/M2极化平衡,从而减轻炎症反应,有效改善肾小球系膜基质的增厚,肾间质纤维化和糖原的沉积[50]。研究发现,梓醇能够抑制RAGE/RhoA/ROCK信号通路的激活,减少VEGF的分泌,增加Occludin和VE钙黏蛋白的表达,从而改善内皮功能障碍和炎症反应[51-52]。

4.1.5 山柰酚山柰酚是中药山奈的有效成分,来源于葡萄、草莓、银杏叶和十字花科的蔬菜,发挥着抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗糖尿病活性,具有增强机体免疫、神经保护和心脏保护作用[53]。研究表明,山柰酚抑制RhoA/ROCK活性,从而导致RhoA膜易位,ROCK2表达受抑制。与此同时,可以降低IL-1β的表达,展示其抗炎的特征。总之,山柰酚抑制RhoA的激活,抑制氧化应激、促炎细胞因子(IL-1β和肿瘤坏死因子α)以及纤维化(转化生长因子-β1和细胞外基质的表达)[54-55]。

4.1.6 桉油醇桉油醇是桉树果实中提取的化合物,具有抗菌、抗炎、杀菌止痛等药理作用。研究表明,桉油醇可通过抑制RhoA介导的GSK3β下游通路的激活,从而改善屏障功能障碍和蛋白尿。GSK3β是足细胞局灶性黏附中Rho/ROCK信号通路的下游介质,桉油醇可以阻断RhoA和GSK3β二者之间的激活。桉油醇可减弱葡萄糖暴露的足细胞和糖尿病肾脏中RhoA、Rac1和Cdc42的诱导,通过调节这些分子开关,改善肌动蛋白细胞骨架,并且保持强大的局灶黏附组装,从而抑制足细胞的屏障功能障碍以及由此所产生的蛋白尿[56]。

4.1.7 芦丁芦丁是中药芸香、荞麦的主要有效成分,具有降低氧化应激,抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗心肌损伤、抗肿瘤和保护肾脏免受损伤的作用[57]。研究表明,芦丁可通过激活Nrf2抑制RhoA/ROCK信号通路,减轻葡萄糖诱导的肾小球内皮屏障功能的破坏,主要用于DN血管病变的治疗,减少氧化应激,减轻肾脏的损伤[58]。

4.1.8 白藜芦醇藜芦醇是中药虎杖的有效成分,具有抗炎、抗感染、心血管保护、神经保护和肝脏保护的作用[59]。研究表明,白藜芦醇可通过调节血管生成延缓DN的进展。肾小球中的胶原沉积主要通过RhoA/ROCK信号通路,因此早期DN肾小球硬化主要途径可能是RhoA/ROCK信号通路,通过抑制RhoA/ROCK信号通路可显著减轻DN相关的肾小球硬化[60]。

4.1.9 丹酚酸A丹酚酸A是中药丹参的有效成分,发挥抗氧化、抗血栓、抗肝纤维化、心肌缺血保护、神经保护和防治糖尿病及其并发症的作用[61]。研究表明,丹酚酸A对肾小球微血管内皮细胞的保护作用可能与抑制AGEs激活的RhoA-ROCK和随后MLC调节的细胞骨架紊乱有关,可通过减轻足细胞损伤,抑制氧化应激和炎症反应,发挥肾脏保护作用[62]。

4.1.10 黄连素黄连素是中药黄连的有效成分,具有控制血压、控制血糖、抗炎、抗心肌缺血、抗心律失常、抗病原微生物、调节免疫和抗肿瘤的药理作用[63]。研究表明,黄连素可通过抑制RhoA/ROCK信号通路来抑制纤连蛋白(fibronectin,FN)的积聚,减少细胞间黏附分子-1、转化生长因子-β1和FN的过度产生,抑制RhoA/ROCK信号通路,发挥抗氧化应激作用[64]。

4.1.11 青藤碱青藤碱是中药青风藤的有效成分,具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤和抗制移植物排斥等作用[65]。研究表明,青藤碱具有抗炎和肾脏保护作用,可治疗HG诱导的DN血管高通透性,通过激活核因子相关因子2(nuclear factor correlation factor 2,Nrf2),保护肾内皮屏障功能,阻断ROS的产生,抑制RhoA/ROCK信号通路,从而激活Nrf2介导的防御反应,达到预防HG诱导的氧化损伤的目的[66]。

4.1.12 灯盏花乙素灯盏花乙素是灯盏花中提取的黄酮苷,能够有效预防糖尿病心肌病和视网膜病变,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗纤维化和改善心脑缺血等作用[67]。研究表明,灯盏花乙素能够通过下调RhoA/ROCK介导的炎症反应和纤维化发挥肾脏保护作用[68]。

4.2 中药组方及制剂对RhoA信号通路的影响

4.2.1 益肾化湿颗粒益肾化湿颗粒的药物组成包括茯苓、泽泻、柴胡、黄连、人参、黄芪、陈皮、白术、白芍、羌活、独活、防风、半夏、炙甘草、大枣和生姜。药理作用主要是增强免疫力。其中,黄芪可以提升网状内皮细胞的吞噬功能,茯苓可通过激活腺苷酸激活蛋白激酶,从而减弱成纤维细胞的激活,减少异常细胞外基质的沉积,降低蛋白尿。研究表明益肾化湿颗粒可以改善DN患者的炎症状态,降低蛋白尿,改善肾功能,其作用机制是部分抑制RhoA/ROCK1/NF-κB信号通路,调控下游炎症因子 IL-6、TNF-α的表达,抑制AGEs损伤足细胞,还可以降低早期DN患者的C反应蛋白和IL-8的表达,从而抑制炎症反应,保护早期DN[69]。

4.2.2 六味地黄丸六味地黄丸由熟地黄、山萸肉、茯苓、泽泻、山药和牡丹皮组成,现代药理研究表明此方可以抗氧化,延缓衰老,调节血糖、血脂、血压、免疫,保护血管内皮,抑制肿瘤细胞生长等[70]。研究表明,六味地黄丸可以明显抑制RhoA、ROCK1 的表达,减轻患者的肾损害,其机制是显著降低RhoA、ROCK1的表达,抑制肾脏的肥大,改善病理,潜在的药理机制主要是和炎症反应、氧化应激、细胞凋亡以及免疫的调节有关,通过减轻肾小管上皮细胞的氧化损伤以及细胞凋亡从而延缓间质纤维化的进程[71]。

4.2.3 自拟益气养阴活血方自拟益气养阴活血方的药物组成是生地黄、生黄芪、积雪草、菟丝子、水蛭和大黄,拟方依据是久病虚瘀入络,治以活血化瘀,益气养阴。研究表明,此方可通过抑制TRPC6和RhoA的表达,减少24小时尿蛋白定量,改善肾脏病理,保护足细胞,同时改善生化血脂血糖的情况[72]。

4.2.4 肾康注射液肾康注射液由大黄、丹参、红花、黄芪组成,研究表明肾康注射液可显著改善DN患者的胰岛素抵抗、糖脂代谢和肾功能,改善肾小球硬化和局灶性足突的消失,主要是通过有效控制糖肾大鼠的血清总胆固醇和三酰甘油水平,进而抑制大鼠的内皮损伤程度和氧化应激反应实现的。与此同时,该注射液可通过调节IL-6、TGF-β1、VCAM-1、ICAM-1、α-SMA,改善炎症反应和肾间质纤维化,调控RhoA、ROCK1的表达,保护肾脏组织[73]。

4.2.5 肾康丸肾康丸的药物组成是黄芪、刺五加、刺蒺藜、玉米须、白头翁、益母草、蝉蜕、山楂8种药物,具有补肾健脾、活血利湿的功效。研究表明,肾康丸可通过增加neparin和podocin的表达来保护足细胞免受损伤,抑制AURKB、racGAP1和RhoA的表达,发挥肾脏保护作用[74]。

表2 中药组方及制剂通过靶向RhoA改善糖尿病肾病的作用机制

5 总结与展望

RhoA信号通路在DN的发生发展中发挥着关键作用,可作为DN的治疗靶点。中医药治疗DN具有多组分、多靶点、副作用小的优势。国内外的相关实验研究表明,RhoA信号通路参与了DN的氧化应激、炎症反应、肾脏纤维化、内皮功能障碍和足细胞损伤。现有研究仍存在不足之处:(1)RhoA在DN中作用机制比较复杂,涉及氧化应激、炎症、自噬等,后期多是肾脏纤维化,尚未明确是通过单一靶点还是多靶点调控RhoA干预DN。(2)针对中药组方及其制剂和中药单体作用于RhoA的研究,下游通路主要集中于ROCK,缺少对其他通路的研究。(3)RhoA信号通路和DN之间的关系研究相对较少,多集中在炎症反应的研究。以后可以进一步拓展炎症方向的研究,进一步明确中药单体及复方的作用机制,为实验提供理论支撑。