基于HPLC-ELSD法测定石斛原浆饮品中水解甘露糖

孙琦琦 朱帅 阮小娇 张水锋 盛华栋

石斛作为兰科植物的一大属，具有不俗的养生保健及药用价值，近年来市面上也出现许多以石斛为原料的石斛原浆饮品。石斛多糖作为其重要的生物活性物质，主要由甘露糖及葡萄糖通过糖苷键结合形成。甘露糖是石斛多糖的重要组成成分及质量评价指标，具有调解免疫系统、抑制肿瘤生长及转移等生理效应。因此，通过测定石斛原浆饮品中甘露糖含量可以进一步提升对石斛原浆饮品的质量指标把控。石斛原浆饮品中的甘露糖通常以葡甘露聚糖的形式存在，因此要将样品中的葡甘露聚糖先提取纯化后，再将其中的甘露糖解离为游离态后进行测定。

目前，对石斛或石斛原浆饮品中甘露糖的测定方法多参考《中国药典（2020版）》，采用水提醇沉提取，盐酸水解多糖，柱前衍生化高效液相色谱法测定。虽然这种方法能够检测出样品中甘露糖的含量，但却存在操作繁琐、时效性不强等缺点。本文基于高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）， 建立了一种非衍生直接测定石斛原浆饮品中水解甘露糖含量的方法，具有线性关系好、稳定性好、回收率高、测定结果准确等优点。

一、仪器与试剂

1.实验仪器。LC-20A液相色谱仪（日本岛津公司）；Alltech 3300 ELSD蒸发光散射检测器（美国奥泰公司）；Milli-Q超纯水儀（美国Millipore公司）；MS 105 DU电子天平（梅特勒-托利多集团）；电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；烘箱（德国BINDER公司）；QT-1涡旋混合器（上海琪特分析仪器有限公司）；ST 16R高速离心机（赛默飞世尔科技有限公司）。

2.实验试剂。无水乙醇（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）； 盐酸（分析纯，杭州双林化工试剂有限公司）；氢氧化钠（分析纯，西陇科学股份有限公司）；氨水（分析纯，无锡展望化工试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，德国默克公司）。

实验用水为一级水；实验用石斛原浆饮品购置于杭州某超市。

二、实验与方法

1.标准溶液配置。（1）甘露糖标准储备液（浓度为10mg/mL）：准确称取100.00mg（精确至0.01mg）甘露糖标准品，用水溶解，转移至10mL容量瓶中，用水定容，混匀，甘露糖浓度为10mg/mL，于4℃保存。

（2）甘露糖系列标准工作液：分别吸取甘露糖标准储备液0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mL于10mL容量瓶中，用水定容，混匀，甘露糖系列标准工作液浓度分别为20、50、100、200、500、1000mg/L。

2.样品制备。（1）纯化：准确移取5mL均匀样品于50mL离心管中，加入40mL无水乙醇，涡旋混匀并于-18℃下放置20min。取出后于高速离心机中以6000r/min离心5min，弃去上清液，向沉淀中加入80%乙醇水溶液45mL，重复上述纯化步骤2次。

（2）提取：将纯化处理后的残渣于101℃烘箱中彻底干燥（2h以上），精密加入10mL水，涡旋混匀，置于100℃水浴提取30min，取出后放冷，并以6000r/min离心5min，收集上清液。

（3）水解：准确吸取5mL上述离心后的上清液于10mL比色管中，加入3mol/L盐酸溶液2mL，盖上塞子后涡旋混匀，并于100℃水浴中水解1h。取出后放冷， 用5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，转移至10mL容量瓶并用水定容至刻度，混匀，过0.22μm滤膜，待上机测定。

3.色谱条件。XBridge Amide色谱柱（250mm×4.6mm，3.5μm）；流动相为0.1%氨水乙腈溶液-0.1%氨水水溶液（80：20）；流速：1.0mg/min；柱温：40℃；进样量：20μL；漂移管温度：50℃；载气流速：1.5L/min。

4.结果计算。按照下方公式计算样品中甘露糖含量：

上式中，X为试样中甘露糖的含量，mg/mL；C为试样溶液中甘露糖的质量浓度，mg/L；V为定容体积，mL；f为稀释倍数；m为试样称样量，g；1000是指换算系数。

三、结果与分析

1.色谱条件优化。本实验探究不同流动相组成对目标化合物分离程度及色谱峰型的影响，分别采用乙腈-水体系及0.1%氨水乙腈溶液-0.1%氨水水溶液体系对目标物进行分析。结果发现，两种流动相体系都可以达到将目标化合物完全分离的效果，但采用乙腈-水体系进行分析时，色谱峰型表现不理想，而后者能够得到较好的色谱峰型，故最终采用0.1%氨水乙腈溶液-0.1%氨水水溶液的流动相体系。

2.标准工作曲线、检出限、定量限。将配置好的甘露糖系列标准工作液注入蒸发光高效液相色谱（HPLC-ELSD）仪进行检测，以甘露糖系列标准工作液响应峰面积的自然对数为纵坐标Y，其浓度的自然对数为横坐标X，得到此标准曲线的线性回归方程为Y=1.3446X+7.6299（图1），线性范围为20mg/L-1000mg/L，相关系数R2=0.9999。当甘露糖的添加浓度为0.02mg/mL时，测得的色谱峰信噪比约为3，当甘露糖的添加浓度为0.04mg/mL时， 测得的色谱峰信噪比约为10。由此得出，本方法中甘露糖的检出限为0.02mg/mL，定量限为0.04mg/mL。

3.回收率、精密度。对经过纯化处理的样品进行3个水平（分别为0.160、0.800、3.200mg/mL）的加标回收测试，每个水平分别测定6次，计算回收率和相对标准偏差，结果见表1。由表1可知，3个水平的回收率在87.5%-101.1%，相对标准偏差（RSD）在1.33%-2.31%。

4.石斛原浆样品中甘露糖的含量。对3种市售石斛原浆样品中甘露糖的含量进行测定，结果如表2所示。

四、结论

与现有方法相比，通过无水乙醇纯化，纯水提取后盐酸水解并采用高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）技术测定石斛原浆饮品中甘露糖的含量，有效解决了甘露糖无特征发光发色基团的问题，省去回流、衍生等繁琐步骤，具有良好的线性范围、较低的检出限、较高的精密度，适用于石斛原浆饮品中甘露糖含量的测定。