樱桃保藏过程中致腐微生物分离鉴定及系统发育树绘制

黄子健 卢泽芳 王立英

樱桃又名车厘子，有“百果第一枝”的美誉，被誉为“水果中的钻石”。樱桃富含多酚和维生素C等多种营养成分，具有抗炎、抗氧化，预防高血压、心血管疾病以及补血等作用。樱桃肉质柔嫩、皮薄多汁，容易受到葡萄孢属、草酸青霉的影响出现腐烂。本研究对樱桃在贮藏过程中出现的腐烂组织块进行了分析，分离及纯化出致病菌，并进行PCR扩增测定序列，进行其系统发展树的绘制，以期为樱桃的相关研究提供参考。

一、材料与试剂

1.材料。樱桃，产地大连。

2.试剂与仪器。70%乙醇、胰胳大豆胨培养基（TSB）、琼脂粉、细菌基因组提取试剂盒、磁珠法细菌和真菌基因组提取试剂盒、琼脂糖、PCR产物磁珠法纯化试剂盒、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、电子天平、离心机、PCR仪、电泳仪、测序仪、BGI 2xSuper PCR Mix（with dye）、BGI D2000 Plus DNA Ladder

二、实验与方法

1.胰胳大豆胨琼脂培养基（TSA）配备。按照胰胳大豆胨培养基（TSB）的说明书，按比例配备胰胳大豆胨液体培养基，加入体积的18%配成胰胳大豆胨琼脂培养基（TSA）。

2.致病菌分离纯化。用手术刀切除腐烂部分的樱桃，将其浸泡在70%乙醇溶液中约30s，迅速置于无菌纸上，使其吸干乙醇溶液。随后用无菌水清洗组织块，然后植入预备好的TSA培养基中，在28℃的恒温箱中培养48h。通过这种培养方法，获得两种形态不同的真菌，利用接种环进行挑离并划线传代，在分离纯化3-4次后获得两株纯菌株A1和A2。

3.光学显微镜镜检。观察A1和A2两个菌株在TSA平板上生长的菌落，随后用无菌针挑取菌落的一小部分，在光学显微镜下进行检查，研究菌落的外观特征。

4.基因组DNA提取。（1）柱式法提取。取一个2mL的离心管，加入200?L的预处理液和适量小玻璃珠，然后加入相应量的菌样品，将混合物放入研磨仪中进行研磨。加入20?L蛋白酶K（Proteinase K），再加入200?L裂解液，充分颠倒混匀，在70℃环境下放置10min。加入200?L无水乙醇，进行充分颠倒混匀，最后轻轻离心以去除管盖内的液滴。接着进行吸附柱处理，用洗涤液洗涤一次，随后进行两次漂洗液的洗涤。将吸附柱放置在室温下3-5min，确保吸附材料中的残留漂洗液充分晾干。将吸附柱内容物转移到新的离心管中，向吸附膜的中间位置悬滴50-100?L双重去离子水（ddH2O），在室温下静置3-5min，以12000r/min的速度离心2min，将溶液收集到离心管中。

（2）磁珠法提取。按照试剂盒说明书分装样品板、磁珠板、洗涤板、洗脱板，并放置提取仪对应工位，运行细菌提取程序至结束。

5.18S扩增。对真菌基因组DNA进行PCR扩增，使用表1中列出的引物。每个PCR反应体系的总体积为25?L，其中PCR Mix占比21?L，正向引物和反向引物各占比1?L，模板DNA占比2?L。

6.PCR产物分析和提纯。取3?L的PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶检测，观察DNA条带的特征。通过凝胶成像分析系统检查PCR扩增后的DNA条带是否明显。为了纯化PCR产物，采用磁珠纯化标准操作流程：根据物质的电荷特性，在高盐和低pH条件下吸附DNA，然后在低盐和高pH条件下释放DNA，从而实现对DNA产物的分离和纯化。

7.测序。通过试剂盒对PCR得到的DNA进行切胶回收，然后进行纯化，最终进行测序分析。

8.系统发育树的构建。使用NCBI中的Blast工具将已测序的DNA与GenBank数据库中已记录的DNA序列进行比对，寻找同源性、相似性。如果18S rDNA序列的同源性大于98%，则被判定为同一个物种。为了计算遗传距离，选取属内同源性较高的序列，并使用Mega 6.0软件构建系统发育树。

三、结果与分析

1.致病菌分离生长结果。对樱桃腐烂组织进行致病菌分离纯化后，得到菌株A1和A2，形态评价见表2。

2.PCR扩增与测序结果。对贮藏过程中樱桃腐烂组织中分离纯化的致病菌提取基因组DNA，对其进行稀释制备PCR的反应模板。然后使用真菌的18S rRNA区域，采用ITS1和ITS4引物进行PCR扩增。得到长度约为700bp左右的序列。其琼脂糖凝胶检测结果见图1。在测序中，菌株A2测序套峰，无法拼接比；菌株A1正常。

3.Blast检测结果。从樱桃腐烂组织中鉴定分离得到菌株A1，对PCR扩增产物进行测序，最終获得菌株A1的18S rDNA基因序列，将其与GeneBank中的序列进行Blast，结果见表3。选取相近的典型菌株的基因序列，用Mega 6.0软件构建系统发育树。从所构建的系统发育树来看，A1和Coprinopsis pseudofriesii strain SZMC-NL-2631（HQ847016.1）亲缘关系较近。

本研究从樱桃保藏过程中的腐烂组织中分离纯化出菌种A1，在形态及显微镜镜检下观察，可见其菌落特征，形态上具有真菌特点。通过PCR扩增及系统发育树的构建，发现其和Coprinopsis pseudofriesii strain SZMC-NL-2631（HQ847016.1）有较近的亲缘关系，可以为后续研究樱桃的保藏提供理论基础。