CHB血清核心抗体与HBV-DNA、HBsAg、肝脏组织纤维化分期相关性及临床意义*

姚挺英 柳丽娟 廖柏涛 魏玉仙

福建医科大学孟超肝胆医院（金山院区）检验科，福建福州 350007

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）持续感染引起的一种肝脏疾病，若临床未及时进行有效干预，部分患者可进展为肝硬化、肝纤维化、肝癌，这是全球范围内面临的一个重要的公共卫生问题[1-2]。HBV属嗜肝DNA病毒，具有较强传染性、环境适应性，最初入侵机体后可在固有免疫防御中逃避[3]，随着慢性HBV持续感染，导致宿主的固有免疫和适应性免疫应答功能障碍，引起肝脏组织发生不同程度炎症，进一步发展为肝纤维化，最终发展为肝硬化、肝癌[4]。可见，评估患者肝纤维程度及进展性在HBV患者临床管理中起着重要的作用。

临床常选用肝穿刺活检作为肝纤维化诊断的金标准，虽具有一定应用价值，但因属于侵入性操作可损伤机体[5]。HBV-脱氧核糖核酸（HBV-DNA）载量、HBV血清检测、肝功能五项及肝纤维化血清标记物等可用来诊断CHB和评估病情严重程度[6]，其中HBV-DNA是HBV感染最直接、特异性强和灵敏性高的指标[7]，HBV血清检测（即乙肝五项）是诊断HBV感染常用的临床指标，而肝功能五项存在低特异度、低灵敏度的缺陷[8]，肝纤维化血清标记物无法对早期CHB进行诊断[9]。基于此，本研究尝试分析CHB血清核心抗体与HBV-DNA、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、肝脏组织纤维化分期相关性及临床价值，旨在为临床诊断CHB提供临床参考。

资料与方法

1 研究对象

将2018年1月—2022年12月于福建医科大学孟超肝胆医院感染科住院并行肝脏穿刺活检的CHB患者作为研究对象。纳入标准：（1）CHB患者依据中华医学会《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》诊断[10]；（2）入选前乙型肝炎表面抗原持续阳性不低于六个月。排除标准：（1）乙肝病毒感染以外的其他肝病或人类免疫缺陷病毒感染；（2）合并有脏器肿瘤；（3）肝组织活检所取的标本长度不足15 mm或肝组织纤维化分期不明确；（4）临床资料和常规实验室检测指标不完整；（5）既往接受过抗病毒治疗或三个月内使用降酶药物；（6）其他原因所致的肝硬化，如高脂血症、酒精肝、非酒精肝等。总共200例CHB初治患者纳入本研究，其中男116例，女84例；年龄24～68岁，平均（43.64±11.65）岁；体质量指数21.6～27.2 kg/m2，平均（24.23±0.99）kg/m2；病程8个月～18年，平均（8.71±3.19）年；肝脏炎症分级：9例G0， 26例G1， 63例G2，67例G3，35例G4；肝脏纤维化分期：50例S1期，50例S2期，50例S3期，50例S4期。本研究根据纤维化严重程度分为轻度组（S0～S1期，50例）、中重度组（S2～S4期，150例）。本研究得到福建医科大学孟超肝胆医院伦理委员会的批准（审批号：20170045）。

2 方法

2.1 临床资料和实验室指标

患者临床资料通过住院电子病历获取，包括年龄、性别、既往病史等，所有患者均在肝脏穿刺活检前一周内采集外周血检测相关实验室指标。HBcAb由北京万泰生物caris200化学发光免疫分析仪进行定量检测，标本OD值/临界OD值比值（S/CO）测定HBcAb＜1S/CO为阳性；HBsAg由美国雅培i2000全自动化学发光仪进行检测，HBsAg检测值＞1S/CO为阳性；采用贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪检测血清天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷氨酰转移酶（glutamyl transpeptidase，GGT）、免疫球蛋白、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）；采用迈瑞BC-6600plus全自动血细胞分析仪检测血小板计数（platelet count，PLT）、白细胞计数（white blood cell count，WBC）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）等指标；采用STAGO全自动凝血分析仪检测凝血酶原国际比值；甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）由日本富士LumipulseG1200全自动化学发光酶免疫分析仪检测；采用深圳新产业MAGLUMI化学发光检测仪检测血清层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原N端肽、透明质酸、Ⅳ型胶原；采用实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA，由西安天隆核酸提取仪进行血清核酸提取，由TIB-8600实时荧光定量PCR仪进行扩增，试剂盒购于泰普生物科学有限公司。其中HBV-DNA结果以log10IU/mL为单位进行转换，定量检测线性范围为：2.0×101IU/mL～1.0×109IU/mL，最低检出限为10 IU/mL，病毒载量＞20 IU/mL为阳性。

2.2 APRI和FIB4指数

计算天门冬氨酸氨基转氨酶与血小板比率指数（aspartate aminotransferase and platelet ratio index，APRI）、FIB4指数，APRI=AST/ULN×100/PLT（109/L），ULN为AST正常上限值；FIB4=[年龄×AST]/[PLT（109/L）×ALT的平方根][11]。

2.3 观察指标

（1）单因素分析轻度组、中重度组患者临床资料（年龄、性别、体质量指数、肝脏炎症分级）、实验室指标（ALT、AST、GGT、ARPI、FIB4、凝血酶原国际比值、免疫球蛋白、TBIL、ALP、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原N端肽、透明质酸、Ⅳ型胶原、PLT、WBC、Hb、甲胎蛋白、HBcAb、HBV-DNA、HBsAg）。

（2）分析HBcAb与HBV-DNA、HBsAg、肝脏组织纤维化分期相关性。

（3）采用LASSO回归筛选变量，分析中重度肝脏组织纤维化的相关影响因素。

（4）受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）分析肝脏炎症分级、HBcAb、HBV-DNA、HBsAg诊断中重度肝脏组织纤维化的价值。

3 统计学方法

使用SPSS 25.0软件分析数据，计数资料以[n（%）]表示、χ2检验，等级资料用Ridit检验；计量资料采用K-S正态性检验，确认近似服从符合正态分布规律，采用t检验，以（）表示；相关性分析采用Spearman/Pearson相关系数模型，运用LASSO回归筛选变量，诊断效能分析采用ROC曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 中重度肝脏组织纤维化的单因素分析

中重度组病程长于轻度组，肝脏炎症分级分布较轻度组严重，ALT、AST、TBIL、ALP、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原N端肽、透明质酸、Ⅳ型胶原、HBcAb高于轻度组，HBV-DNA、HBsAg低于轻度组（P＜0.05）。见表1。

表1 中重度肝脏组织纤维化的单因素分析

2 HBcAb与HBV-DNA、HBsAg、肝脏组织纤维化分期相关性

相关性分析显示，HBcAb与肝脏组织纤维化分期呈正相关（rs=0.285），与HBV-DNA、HBsAg呈负相关（r=-0.384、-0.354，P＜0.05）；HBVDNA、HBsAg与肝脏组织纤维化分期呈负相关（r=-0.265、-0.266，P＜0.05）。见图1。

图1 HBcAb与HBV-DNA、HBsAg相关性

3 Lasso推论模型分析

运用R语言glmnet程序包，以肝纤维化情况（赋值：轻度=0，中重度=1）为因变量，以单因素分析中P＜0.05的13个变量为自变量：病程、肝脏炎症分级、ALT、AST、TBIL、ALP、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原N端肽、透明质酸、Ⅳ型胶原、HBcAb、HBVDNA、HBsAg进行LASSO回归分析（除肝脏炎症分级赋值G0=0，G1=1，G2=2，G3=3，G4=4外，其余变量均为连续变量，按实际值赋值），随着惩罚系数λ变化，模型初始纳入的13个影响因素的系数被压缩，避免了模型的过度拟合，达到最佳影响因素选择的效果图（图2）。采用交叉验证法绘制均方误差随logλ的变化图（图3），寻找到可使模型性能优良且影响因素最少的最佳惩罚系数λ，即图中虚线对应的λ=-2.30。依据此λ值选出4个预测变量为肝脏炎症分级、HBcAb、HBV-DNA、HBsAg。肝脏炎症分级、HBcAb、HBV-DNA、HBsAg是中重度肝纤维化相关影响因素（P＜0.05），见表2。

图2 LASSO回归筛选变量动态过程图

图3 交叉验证最佳参数λ的选择过程图

表2 Lasso推论模型的二项Logistic回归分析结果

4 中重度肝脏组织纤维化的无创诊断分析

绘制肝脏炎症分级、HBcAb、HBV-DNA、HBsAg诊断中重度肝脏组织纤维化的ROC曲线显示，HBV-DNA诊断的AUC最大，诊断敏感度为88.00%，特异度为62.00%；采用SPSS联合应用ROC理论模式，对各单独项目进行综合回归，建立Logistic诊断评估模型，用以分析四者联合诊断价值，结果显示，四者联合诊断的AUC为0.920，大于任一单一项目（Z=5.009、3.142、4.683、4.441，均P＜0.05），联合诊断敏感度为90.00%，特异度为82.00%，见图4、表3。

图4 中重度肝脏组织纤维化的无创诊断ROC曲线

表3 中重度肝脏组织纤维化的无创诊断ROC分析结果

讨 论

CHB是一种免疫细胞介导的肝脏损伤[12]，慢性HBV侵袭机体后HBV-DNA大量复制可激活体内非特异性免疫，改变肝内结缔组织增生，诱导肝细胞外基质大量合成并募集在肝脏，可导致肝纤维化发生，因此，CHB也被认为是免疫性肝炎[13]。机体一旦发生肝纤维化很难逆转，临床应尽早预防或发现肝纤维化，可有效预防CHB疾病进展[14]。

本研究单因素分析显示，ALT、AST、TBIL、ALP、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原N端肽、透明质酸等13个变量可能是中重度肝脏组织纤维化的影响因素。由于影响其相关因素较多，为避免出现过拟合现象，本研究运用R语言glmnet程序包，以单因素分析中P＜0.05的13个变量进行LASSO回归分析，随惩罚系数λ变化，模型初始纳入的13个影响因素的系数被压缩，避免了模型的过度拟合，其中HBcAb、HBVDNA、HBsAg、肝脏炎症分级4个变量λ未归零，以上4个变量均是影响中重度肝纤维化相关影响因素。

HBV-DNA载量是评价HBV复制活跃程度的重要手段，也是治疗CHB复发的关键因素 。YANG等[15]报道称，CHB患者经抗纤维化治疗，肝纤维化水平、HBV-DNA载量明显改变，同时肝组织损伤也得到明显改善。HBV血清学检查（乙肝5项）是临床判断CHB患者感染、评估病情的常用指标，可从不同角度反映患者HBV感染情况[16]。HBcAb是体内免疫系统产生的一种中和性抗体，在HBV感染早期发生阳转；LI等[17]研究发现，中重度纤维化患者血清HBcAb水平高于单纯CHB患者或轻度纤维化患者，说明HBcAb在评估患者肝纤维化中发挥着重要作用。有研究显示，HBcAb水平与HBV感染后不同时期密切相关，在免疫耐受期水平HBcAb较低，随HBV大量复制可激活机体非特异性免疫过程，导致HBcAb在免疫清除期水平升高，在非活动HBsAg携带者或低复制时期HBcAb水平就很低，表明HBcAb水平高低与炎症密切相关[18]。HBsAg是乙肝病毒的外壳蛋白，自身不具备传染，常伴HBV存在，是HBV感染的标记，HBsAg水平高低可反映HBV在肝细胞复制中的活跃程度[19]。临床研究发现，低水平HBsAg患者通过干扰素联合核苷类药物治疗可提高HBsAg清除率，治愈率较高[20]。肝脏纤维化或炎症是慢性HBV感染疾病进展的关键因素，2019年版中国《慢性乙型肝炎防治指南》指出肝脏组织炎症分级≥G2或纤维化≥S2，疾病进展风险较高，需要接受抗病毒治疗，以延缓疾病进展[10]；目前，肝脏活检穿刺是评价肝纤维化诊断的金标准，可用于评估患者肝纤维化程度和肝脏炎症[21]。本研究发现，中重度组HBcAb高于轻度组，HBVDNA、HBsAg低于轻度组，这与LI等[17]研究相似，与NISHIDA等[22]研究结果不一致。而曾艳丽等[23]研究发现，肝纤维化程度越严重，HBcAb越高，HBVDNA、HBsAg水平越低，提示HBcAb与HBV-DNA、HBsAg呈负相关，与肝纤维化严重程度呈正相关，且HBcAb＞10标本OD值/临界OD值比值为截断值时，预测中重度肝纤维化的敏感性为72.9%、特异度为52.63%。本研究经Spearman/Pearson相关分析显示，HBcAb与肝脏组织纤维化分期呈正相关，与HBVDNA、HBsAg呈负相关，与上述结果一致。本研究将肝脏炎症分级、HBcAb、HBV-DNA、HBsAg绘制ROC曲线，发现以上因素联合诊断中重度肝脏组织纤维化的AUC优于单独诊断，敏感度为90.00%、特异度为82.00%，提示其联合预测具有一定诊断效能。

综上所述，血清HBCAb与肝纤维化呈正相关，与HBV-DNA和HBsAg呈负相关，且以上指标联合诊断中重度肝脏组织纤维化具有一定临床诊断价值，本研究为进一步了解CHB免疫学机制提供参考，并为中重度肝纤维化的无创诊断提供一种新方法。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突