烟草NtHPL1基因克隆、表达及功能分析

和 顺，马兰馨，陈钰栋，武明珠，徐 馨，李泽锋，高 茜，杨 军，黄平俊，王 中*

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001 2.云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明市五华区科医路41 号 650106 3.湖南中烟工业有限责任公司技术中心，长沙市劳动中路386 号 410007

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）途径是植物体内脂肪酸氧化的重要途径［1］，LOX 可催化亚油酸和亚麻酸等脂肪酸形成脂氢过氧化物，这些脂氢过氧化物通常不稳定，能够被二乙烯基醚合成酶（divinyl ether synthase, DES）、丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase, AOS）、过氧合酶（peroxygenase,POX）和脂氢过氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase,HPL）催化［2］。其中，HPL 是LOX 途径的关键酶，根据催化底物的过氧基位置分为3 个亚族（9-HPL［3］、13-HPL［4］和9/13-HPL［5］），可通过裂解脂氢过氧化物的碳-碳键形成挥发性醛和酸［6］。HPL 可参与甜瓜和鹰嘴豆等植物对盐和干旱胁迫的响应，相关研究已见报道。刘苗苗等［7］发现与未经胁迫处理（对照）的甜瓜幼苗相比，干旱和NaCl 胁迫处理后的幼苗CsHPL基因相对表达量升高，分别为对照的181.02%和162.41%。Domenico 等［8］发现鹰嘴豆根系中的HPL 基因（MtHPL1 和MtHPL2）干旱胁迫处理后相对表达量升高，MtHPL1 基因的相对表达量在处理2 h内上调，在2～72 h 内相对稳定；MtHPL2 的相对表达量随干旱胁迫处理时间的增加而升高，在72 h 达到最高值。然而，烟草（Nicotiana tabacum L.）HPL参与盐和干旱胁迫响应的相关研究还鲜见报道。为此，在普通烟草K326 中克隆1 个HPL 基因并命名为NtHPL1，采用生物信息学方法对NtHPL1 蛋白的理化性质、结构域、进化关系等进行系统分析，并采用qPCR 方法分析NtHPL1 基因在烟草不同组织、不同发育时期烟叶、盐和干旱胁迫处理下旺长期烟叶的相对表达量，创制过表达转基因植株，验证NtHPL1基因在烟草抗盐、抗旱方面的生物学功能，以期为创制抗逆烟草新品系提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试培养基分别为MS 固体培养基（MS 培养基粉4.40 g/L、蔗糖30 g/L、琼脂粉3 g/L，pH值5.8）、含NaCl（0 mmol/L）的固体培养基（MS培养基粉4.40 g/L、蔗糖30 g/L、琼脂粉3 g/L，pH 值5.8）、含NaCl（100 mmol/L）的固体培养基（NaCl 5.85 g/L、MS 培养基粉4.40 g/L、蔗糖30 g/L、琼脂粉3 g/L，pH 值5.8）和含NaCl（200 mmol/L）的固体培养基（NaCl 11.70 g/L、MS 培养基粉4.40 g/L、蔗糖30 g/L、琼脂粉3 g/L，pH值5.8）。

将普通烟草K326 种子用体积分数为10%的NaClO 消毒后，在MS 固体培养基中于25 ℃恒温培养，待种子萌发并长出4 片真叶时进行以下处理：①将烟苗移栽至上口径100 mm、下口径65 mm、高度85 mm 的花盆中，培养基质为品氏托普园艺(上海)有限公司的营养土和蛭石，营养土与蛭石的体积比为9 ∶1。移栽后的烟苗置于温室中生长，每天26 ℃光照处理15 h，20 ℃黑暗处理9 h。采集烟草苗期、旺长期、现蕾期、盛花期和成熟期的上部叶片，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于提取烟草基因组DNA（gDNA）和检测不同发育时期烟叶的NtHPL1基因相对表达量；采集烟草盛花期的根、茎、叶片、花和腋芽，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于检测烟草不同组织的NtHPL1 基因相对表达量。②选取长势相同、大小一致的烟苗分别移栽至含NaCl（0、100、200 mmol/L）的3种固体培养基上进行盐胁迫处理，每个培养基移栽8株烟苗，每种处理重复3 次，7 d 后将烟叶用液氮速冻并保存于-80 ℃冰箱，用于检测盐胁迫处理下旺长期烟叶的NtHPL1基因相对表达量。③将烟苗移栽至上口径120 mm、下口径80 mm、高度100 mm的花盆中，长至旺长期时，采用停止浇水的方法创造干旱条件，对烟株进行干旱胁迫处理，并取处理0、2、4、6 d 的烟草上部叶片，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于检测干旱胁迫处理下旺长期烟叶的NtHPL1基因相对表达量。

1.2 烟草基因组DNA提取和RNA提取及反转录

使用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取普通烟草K326基因组DNA。使用GenePure 多糖多酚植物RNA 快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）分别提取1.1 节中采集的烟草不同组织、不同发育时期烟叶、盐和干旱胁迫处理的旺长期烟叶样品RNA，并使用All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix（with dsDNase）反转录试剂盒（北京密码子生物科技有限公司）将提取的RNA分别反转录为cDNA。

1.3 烟草NtHPL1基因克隆

将拟南芥AtHPL 蛋白序列（GenBank ID：9306309）在中国烟草基因组数据库（http：//218.28.140.17）中进行BLASTP 比对。从比对结果中选择同源性最高的序列，并使用Primer Premier 5 软件设计扩增引物NtHPL1-F 和NtHPL1-R（表1），分别以普通烟草K326 的gDNA 和cDNA 为模板进行PCR扩增。反应体系：gDNA（cDNA）模板（100 ng/μL）2 μL，上、下游引物（10 µmol/L）各0.5 μL，高保真聚合酶（北京全式金生物技术有限公司）10 μL，ddH2O补足至20 μL。反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，35 个循环；72 ℃保温7 min。使用凝胶回收试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）回收PCR 产物，并使用DNA 连接酶将回收产物与克隆载体Peasy-T1 相连。将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态（北京全式金生物科技有限公司）后37 ℃过夜培养，对阳性克隆进行测序验证。引物合成和测序验证均由北京六合华大基因科技有限公司完成。

表1 供试引物序列Tab.1 Tested primer sequence

1.4 生物信息学分析

使用DNAMAN 软件将拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）、辣椒（Capsicum annuum）、马铃薯（Solanum tuberosum）的HPL 蛋白与烟草NtHPL1 蛋白进行氨基酸序列比对。查找其他植物的HPL蛋白序列，使用MEGA 7.0软件构建NtHPL1 与其他植物HPL 蛋白的系统发育进化树。烟草NtHPL1蛋白的理化性质用ProtParam在 线 工 具 （https://www.expasy.org/resources/protparam）分析；亲疏水性用ProtScale 在线工具（https://www.expasy.org/resources/protscale）分析；跨膜结构特性用TMHMM 在线工具（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测；二级结构用Sopma在线工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）分析。

1.5 烟草NtHPL1基因相对表达量分析

分别以1.2节中获得的烟草不同组织、不同发育时期烟叶、盐和干旱胁迫处理的旺长期烟叶样品cDNA 为模板，采用qPCR 方法检测烟草NtHPL1 基因的相对表达量。根据NtHPL1基因的CDS序列，使用Primer Premier 5 软件设计qPCR 引物，命名为qRT-NtHPL1-F 和qRT-NtHPL1-R；内参基因为烟草NtL25 基因（GenBank ID：L18908）［9］，内参引物命名为qRT-NtL25-F 和qRT-NtL25-R，引物序列如表1 所示。qPCR 反应体系：cDNA 模板（100 ng/μL）1 μL，上、下游引物（10 µmol/L）各0.5 μL，2×SYBR Green qPCR Mix（北京艾德莱生物科技有限公司）7.5 μL，ddH2O 补足至15 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，45个循环，混合3个样品为1个生物学重复，设置3次生物学重复。采用2-ΔΔCT法计算NtHPL1 基因的相对表达量［10］，使用Microsoft Excel软件对相对表达量进行方差分析，采用LSD法进行数据间的差异显著性分析。

1.6 过表达遗传材料创制及抗逆性分析

为分析NtHPL1 基因在烟草抵抗盐和干旱胁迫过程中的作用，将NtHPL1 基因的CDS 序列连接pCambia 1300 表达载体，构建35S:NtHPL1 过表达载体。将经过测序验证后的过表达载体转化普通烟草K326 无菌苗，创制NtHPL1 基因的过表达遗传材料。采用1.2 节中的方法获得过表达遗传材料的cDNA，并通过1.5节中的方法检测NtHPL1基因相对表达量，鉴定阳性的NtHPL1 过表达转基因株系，筛选出NtHPL1 基因相对表达量最高的过表达株系（NtHPL1-OE），并收集该株系T2代纯合种子。

将过表达烟草（NtHPL1-OE）和野生型烟草（WT）种子培养于MS 固体培养基上，待长至4 片真叶后分别进行盐和干旱胁迫处理。将NtHPL1-OE和WT的烟苗同时移栽至含NaCl（200 mmol/L）的固体培养基上进行盐胁迫处理，并以移栽至MS固体培养基上的处理作为对照（CK1）。每个培养基上NtHPL1-OE 和WT 分别移栽8 株，每个处理设置3 次生物学重复。观察处理7 d 烟苗的生长状况并拍照记录；分别取处理0、5、10、15、20 d NtHPL1-OE（3株）和WT（3株）的叶片，检测叶绿素［11］、脯氨酸和丙二醛（MDA）［12］含量（质量分数）并计算3株含量的平均值。将NtHPL1-OE和WT的种子消毒后分别培养于含NaCl（200 mmol/L）的固体培养基上，重复3次，每个培养基培养30 粒种子，25 ℃培养7 d。分别统计0～7 d 每天累计的发芽数，计算每天的发芽率（发芽率=种子发芽数/测试种子总数×100%）［13］。此外，将NtHPL1-OE 与WT 的烟苗移栽到花盆中，生长至旺长期后各分为4 份，每份NtHPL1-OE 和WT 各3盆，采用1.1节中的方法对4份烟株分别进行0、4、6、10 d 的干旱胁迫处理，以处理0 d 为对照（CK2），观察不同处理下烟株的生长状况并拍照记录；分别取不同处理下NtHPL1-OE（3株）和WT（3株）的上部叶片，检测可溶性糖［14］、叶绿素、脯氨酸、丙二醛（MDA）含量（质量分数）并计算3株含量的平均值。

2 结果与分析

2.1 烟草NtHPL1基因克隆及序列分析结果

分别以普通烟草K326 的gDNA 和cDNA 为模板进行PCR 扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1A 所示。测序结果显示，克隆获得的NtHPL1 基因全长为4 670 bp，包含2 个外显子和1个内含子（图1B），其编码区全长为1 365 bp，编码454个氨基酸，命名为NtHPL1。通过比对拟南芥、番茄、辣椒和马铃薯的HPL 和烟草NtHPL1 蛋白的氨基酸序列，发现NtHPL1 蛋白属于细胞色素P450（CytP450）蛋白质家族，具有CytP450 家族典型的A、B、C和D结构域［15］（图2）。

图1 NtHPL1基因的琼脂糖凝胶电泳图及基因结构Fig.1 Agarose gel electrophoresis and gene structure of NtHPL1 gene

图2 不同植物HPL蛋白序列对比Fig.2 Sequence alignment of HPL proteins in different plants

使用MEGA 7.0 软件构建NtHPL1 与其他植物HPL蛋白的系统发育进化树，结果如图3所示。烟草NtHPL1 蛋白属于13-HPL 亚家族，与渐狭叶烟草（Nicotiana attenuata）关系最近，与番茄、马铃薯、辣椒、拟南芥、葡萄（Vitis vinifera）HPL蛋白也具有较近的亲缘关系。

图3 不同植物HPL蛋白的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree for HPL proteins in different plants

2.2 NtHPL1蛋白结构分析结果

使用ProtParam在线工具分析NtHPL1蛋白的理化性质，分析结果如表2 所示。NtHPL1 蛋白含454个氨基酸，相对分子量为51.20 kDa，脂肪系数为82.38，理论等电点为6.16，正、负电荷残基数分别为47和50个，不稳定性系数为34.46。该蛋白的总平均亲水性为-0.206（正值为疏水性，负值为亲水性）；通过ProtScale 在线工具对该蛋白的亲/疏水性进行分析（图4），发现NtHPL1蛋白的亲水区域（亲/疏水性得分为负值）多于疏水区域（亲/疏水性得分为正值），推测烟草NtHPL1 蛋白属于亲水性蛋白。使用TMHMM在线工具预测NtHPL1蛋白的跨膜区域（图5），发现该蛋白的454个氨基酸均位于膜外，不存在跨膜区域。

图4 NtHPL1蛋白的亲/疏水性预测结果Fig.4 Hydrophilicity/hydrophobicity prediction results of NtHPL1 protein

表2 NtHPL1蛋白的理化性质分析结果Tab.2 Physicochemical properties analysis results of NtHPL1 protein

NtHPL1蛋白的二级结构主要包含a-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲，a-螺旋和无规卷曲分别占38.55%和40.97%（表3）。由图6 可见二级结构在NtHPL1蛋白中的具体分布。其中，a-螺旋主要分布在蛋白的中间，延伸链主要分布在两端。

图6 NtHPL1蛋白的二级结构预测结果Fig.6 Secondary structure prediction results of NtHPL1 protein

表3 NtHPL1蛋白二级结构Tab.3 Secondary structure of NtHPL1 protein

2.3 烟草不同组织及不同发育时期烟叶的NtHPL1基因相对表达量

检测烟草不同组织、不同发育时期烟叶的NtHPL1基因相对表达量，结果如图7A所示。NtHPL1基因在烟草所有组织中均表达，在花中相对表达量最高，在茎中相对表达量最低。烟草不同发育时期烟叶的NtHPL1基因相对表达量不同（图7B），盛花期的相对表达量最低，成熟期的相对表达量最高。

图7 烟草不同组织及不同发育时期烟叶的NtHPL1基因相对表达量Fig.7 Relative expression levels of NtHPL1 gene in different tissues of tobacco and in tobacco leaves at different developmental stages

2.4 干旱和盐胁迫下旺长期烟叶的NtHPL1基因相对表达量

检测干旱胁迫处理0、2、4、6 d 旺长期烟叶的NtHPL1 基因相对表达量，结果如图8A 所示。干旱胁迫处理后烟叶中NtHPL1基因相对表达量升高，处理6 d 的基因相对表达量最高，是处理0 d 基因相对表达量的3.19 倍。为分析盐胁迫对NtHPL1 基因相对表达量的影响，对普通烟草K326 分别进行0、100和200 mmol/L NaCl 处理（图8B），发现100 和200 mmol/L NaCl 处理后的烟叶中NtHPL1 基因相对表达量显著高于0 mmol/L NaCl 处理后的烟叶，分别是0 mmol/L NaCl 处理后烟叶的1.94 倍和2.63 倍。可见，NtHPL1基因表达受干旱和盐胁迫的诱导。

图8 干旱和盐胁迫下烟叶的NtHPL1基因相对表达量Fig.8 Relative expression levels of NtHPL1 gene in tobacco leaves under drought and salt stress

2.5 NtHPL1基因过表达烟草的抗盐和抗旱性

通过转基因技术获得NtHPL1过表达株系，采用qPCR方法从中筛选出NtHPL1基因相对表达量最高的植株（NtHPL1-OE）（图9）。NtHPL1-OE 株系的NtHPL1 基因相对表达量显著高于K326，是K326 NtHPL1基因相对表达量的22.46倍。

图9 NtHPL1转基因烟草的鉴定Fig.9 Identification of NtHPL1 transgenic tobacco

观察NaCl 和CK1 处理下NtHPL1-OE 和WT 的生长状况（图10），发现CK1处理的NtHPL1-OE和WT的生长状况无明显差异；NaCl 处理的NtHPL1-OE 能够正常生长，而WT 叶片发黄萎蔫、根茎矮小，表明过表达NtHPL1 基因能够增强烟草对盐胁迫的抗性。检测盐胁迫处理下NtHPL1-OE和WT的种子发芽率及烟叶中的叶绿素、脯氨酸、丙二醛含量，结果如图11 所示。将种子培养于含NaCl 的固体培养基上，培养7 d 后NtHPL1-OE 的种子发芽率为78.75%，WT 的种子发芽率为66.67%；NaCl 处理0～20 d NtHPL1-OE的叶绿素含量高于WT，且处理15 d NtHPL1-OE的叶绿素含量最高，是处理15 dWT叶绿素含量的6.31 倍；NaCl 处理下NtHPL1-OE 的脯氨酸含量逐渐升高，处理20 d NtHPL1-OE 的脯氨酸含量是处理20 d WT脯氨酸含量的2.41倍；NaCl处理0～20 d NtHPL1-OE 的丙二醛含量均低于WT。以上结果表明，过表达NtHPL1基因能够提高盐胁迫处理下烟草种子的发芽率，调控烟叶中的叶绿素、脯氨酸和丙二醛含量，增强烟草对盐胁迫的抗性。

图10 盐胁迫下NtHPL1过表达烟草的生长情况Fig.10 Growth of NtHPL1-overexpressed tobacco under salt stress

图11 盐胁迫对烟草发芽率及烟叶叶绿素、脯氨酸、丙二醛含量的影响Fig.11 Effects of salt stress on germination rate of tobacco and contents of chlorophyll, proline and malondialdehyde in tobacco leaves

观察干旱胁迫处理下NtHPL1-OE 和WT 的生长状况（图12），发现处理4和6 d的NtHPL1-OE生长正常，与CK2 相比无明显差异，而WT 叶片萎蔫，生长被抑制；处理10 d 的WT 和NtHPL1-OE 均有植株矮小、叶片发黄的症状，但NtHPL1-OE比WT的叶片更大，叶片数量更多。检测干旱胁迫处理下NtHPL1-OE 和WT 叶片中的可溶性糖、叶绿素、脯氨酸和丙二醛含量，结果如图13 所示。干旱处理0～10 d NtHPL1-OE 的可溶性糖含量和叶绿素含量均高于WT。相比处理0 d，处理10 d NtHPL1-OE 的可溶性糖含量降低46.98%，而WT 的可溶性糖含量降低31.81%；处理10 d WT的叶绿素含量降低38.06%，而NtHPL1-OE的叶绿素含量升高4.51%；处理10 d WT和NtHPL1-OE的脯氨酸含量分别增加1.79倍和3.39倍；处理0～10 dNtHPL1-OE的丙二醛含量均低于WT。以上结果表明，NtHPL1-OE受干旱胁迫的影响低于WT，NtHPL1-OE过表达烟草抵御干旱胁迫的能力更强。

图12 干旱胁迫下NtHPL1过表达烟草生长情况Fig.12 Growth of NtHPL1-overexpressed tobacco under drought stress

图13 干旱胁迫对烟叶可溶性糖、叶绿素、脯氨酸及丙二醛含量的影响Fig.13 Effects of drought stress on contents of soluble sugar, chlorophyll, proline, and malondialdehyde in tobacco leaves

3 讨论

本研究中发现烟草NtHPL1 蛋白与同为茄科植物的马铃薯、番茄和拟南芥亲缘关系最近。由于马铃薯［16］、番茄［17］和拟南芥的HPL 蛋白均被定位于叶绿体中［18-20］，推测烟草NtHPL1蛋白可能也位于叶绿体中，但仍需进一步验证。本研究中发现盐和干旱胁迫处理下烟叶的NtHPL1基因相对表达量升高，表明NtHPL1基因可能参与烟草抗逆过程，这与对葡萄VvHPL1 基因的研究结果［21］相似。在盐和干旱胁迫下，NtHPL1过表达烟草叶片的脯氨酸含量比野生型烟草高，丙二醛含量比野生型烟草低，说明NtHPL1过表达烟草的细胞损害程度更小，抗盐性和抗旱性更强，这与Lim 等［22］的研究结果一致。NtHPL1基因是否响应除盐和干旱以外的其他非生物胁迫仍需进一步研究。

4 结论

在普通烟草K326 中同源克隆NtHPL1 基因，该基因编码含454 个氨基酸的蛋白。蛋白结构和发育进化分析结果表明烟草NtHPL1 蛋白属于13-HPL 家族。在烟草根、茎、叶片、花和腋芽中均检测到NtHPL1 基因的表达，在花中NtHPL1 基因相对表达量最高；烟草不同发育时期烟叶的NtHPL1基因相对表达量不同，盛花期最低，成熟期最高；盐和干旱胁迫均能诱导NtHPL1 基因表达，表明该基因可能参与烟草的抗盐、抗旱过程。创制NtHPL1-OE 过表达遗传材料，对野生型烟草和NtHPL1 过表达烟草同时进行盐和干旱胁迫处理，发现处理后的NtHPL1 过表达烟草能够正常生长，而野生型烟草叶片发黄萎蔫；与野生型烟草相比，处理后的NtHPL1 过表达烟草叶片中的叶绿素和脯氨酸含量更高，丙二醛含量更低，具有更强的盐和干旱胁迫耐受性，表明过表达NtHPL1 基因可提高烟草的抗盐性和抗旱性。