基于网络药理学探讨柴胡-黄芩药对治疗病毒性肺炎的作用机制

蒋总 唐芳 马武开 姚血明 刘正奇 兰维娅 周静

(贵州中医药大学第二附属医院,贵州 贵阳 550002)

病毒性肺炎是一种可由多种病毒侵袭导致肺实质炎症的呼吸系统疾患[1]。因此,临床缺乏治疗病毒性肺炎安全有效药物。中医药作为我国传统文化的瑰宝,传承千年而不衰,在防治疾病中起着举足轻重的地位。著名医家钱乙所创六味地黄丸、《伤寒论》所著小柴胡汤因其疗效显著,目前临床应用广泛。柴胡-黄芩来源于小柴胡汤,研究[2-3]表明,小柴胡汤可降低大鼠炎症因子表达,还可下调病毒性肺炎患者体温,在呼吸系统疾病中有良好治疗作用。柴胡-黄芩是小柴胡汤主要君药,早有研究报道柴胡-黄芩配伍有较好清热与抗病毒之功效[4],但是其作用机制仍不清楚。网络药理学通过构建“药物成分-靶点与疾病靶点”相互作用关系,本研究应用网络药理学研究方法探讨柴胡-黄芩药治疗病毒性肺炎潜在的作用机制,为临床应用中医药治疗病毒性肺炎提供依据。

1 资料与方法

(1)数据准备:从TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)查找柴胡-黄芩的主要化学成分,查询条件设置OB≥30%且DL≥0.18进行筛选,获得有效成分和靶点蛋白。(2)药物靶点转换和疾病靶点的筛选:通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将所得药物靶点进行标准化注释。以“viral pneumonia”作为关键词,在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)、Pharm Gkb(https://www.pharmgkb.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)收集病毒性肺炎相关基因。将柴胡-黄芩药对靶点基因与病毒性肺炎靶点基因互相映射筛选出共同靶点,获得柴胡-黄芩治疗病毒性肺炎的作用靶点。(3)活性成分-癌症靶点网络构建:将柴胡-黄芩药对学成分与病毒性肺炎靶点通过Cytoscape3.8.0建立药物主要成分成分靶点-疾病靶点群网络,化合物节点度(Degree)表示药对对应的治疗病毒性肺炎靶点个数,并对Degree较大值进行分析。(4)靶蛋白相互作用(PPI)网络构建:将药对-疾病相关靶点基因上传至在线String10.0软件(https://string-db.org/),通过设置分值高于0.9置信度进行分析数据,生成靶点PPI网络,并且利用RStudio Version 1.2.1335对PPI网络中的蛋白绘制条形图,进一步说明靶蛋白的核心作用。(5)GO功能富集与KEGG通路富集分析:为了说明柴胡-黄芩药对病毒性肺炎靶点蛋白在基因功能和信号通路中的作用,本研究通过RStudio Version 1.2.1335软件对PPI网络靶点蛋白进行GO、KEGG通路富集分析。

2 结 果

2.1 活性化合物的筛选通过TCMSP数据库根据筛选条件共筛选出53个活性化合物。见表1。

2.2 疾病基因筛选通过GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank数据库搜索病毒性肺炎相关的疾病基因,最后得出GeneCards数据库4212个基因,OMIM数据库共91个基因,PharmGkb数据库共6个基因,DrugBank、TTD没有病毒性肺炎相关基因,去除重复基因后共筛选出4238个基因。见图1。

2.3 柴胡-黄芩药对靶点与病毒性肺炎靶点相互作用韦恩图依据GeneCards数据库按Relevance score≥1.0标准筛选目标靶蛋白,通过UniProt数据库转换为基因名称,把GeneCards、OMIM、PharmGkb数据库将疾病靶基因整合,最后将柴胡-黄芩药对与疾病靶点相关基因映射,共发现143个共同基因,确定为柴胡-黄芩药对治疗病毒性肺炎的靶基因。见图2。

2.4 柴胡-黄芩药对靶点病毒性肺炎相互作用网络将药物主要化学成分与病毒性肺炎靶点通过Cytoscape3.8.0建立药物成分靶点-疾病靶点群网络,其中红色表示柴胡,紫色表示黄芩,浅蓝色表示病毒性肺炎靶点,每条边则表示药物活性成分与疾病靶点之间的相互作用关系(图3)。在药物靶点-疾病靶点网络中充分体现了其多成分、多靶点的作用特点。

图3 柴胡-黄芩活性成分-病毒性肺炎靶点网络图

2.5 靶点PPI网络、关键基因分析隐藏游离点后PPI网络包含115个靶蛋白节点,各靶点蛋白具体连线见图4,其中连线越多代表靶点关联越大,再利用RStudio Version 1.2.1335根据所有所得基因进行过滤筛选得到核心基因(过滤条件基因degree≥中位值),再通过Cytoscape3.8.0进行核心基因作图分析,重复两次,最终得到核心基因JUN(degree=20),MAPK14(degree=16),FOS、TP53、FOS、TNF、RELA(degree=14),AKT1、MYC(degree=12),CCND1(degree=9),IL6(degree=8)。见图5。

图4 柴胡-黄芩治疗病毒性肺炎靶蛋白PPI网络

图5 柴胡-黄芩治疗病毒性肺炎关键基因

图6 柴胡-黄芩GO生物过程富集柱状图

2.6 GO生物过程分析通过RStudio Version 1.2.1335把药对与疾病共同靶基因symbol转换基因ID得到136个靶基因,通过在DAVID数据库进行GO生物过程富集,根据错误发现率(FDR)<0.05筛选出2481个GO生物过程。其中response to oxidative stress、reactive oxygen species metabolic process、response to toxic substance、response to reactive oxygen species、response to metal ion、response to molecule of bacterial origin、response to lipopolysaccharide等位于GO生物过程富集的前面。具体见6及图7。可见,病毒性肺炎的发生发展涉及对氧化应激的反应、活性氧代谢过程、对有毒物质的反应、对活性氧的反应、对金属离子的反应、对细菌来源的分子的反应、对脂多糖的反应等生物过程,而柴胡-黄芩药对可通过调节以上生物过程来治疗病毒性肺炎。

图7 柴胡-黄芩GO生物过程富集气泡图

2.7 KEGG信号通路分析通过DAVID数据库将柴胡-黄芩的136个靶基因在KEGG信号通路中富集,根据FDR<0.05筛选出与病毒性肺炎密切相关的信号通路。结果共有123个靶点基因参与KEGG富集通路,包括AGE-RAGE、IL-17、TNF signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、C-type lectin receptor signaling pathway等信号通路,主要与氧化应激、炎症、病毒感染等158条信号通路相关,其中每一条通路都有相对应的通路图,部分通路见图8。

图8 柴胡-黄芩药对KEGG信号通路图

3 讨 论

病毒感染性肺炎一直是肺部感染高发病率和高死亡率的主要原因,通常在几十年内呈季节性变化[5-6]。在近二十年内,全世界范围内前后总共经历了6次重大病毒性感染,其中呼吸道病毒感染有4次,最近一次是自2019年至今的新型冠状病毒肺炎,具有发病率更高、传染性更强、受累人群更多、经济损失最大、侵犯地域更广的特点,严重危害人类身心健康[7]。然而,病毒性肺炎的发病机制尚不清楚,导致临床治疗的盲目性,目前对病毒性肺炎的治疗主要是对症支持治疗,由于呼吸道病毒的高度变异性、耐药菌株的出现、抗病毒药物的不良反应导致许多抗病毒药物的疗效显著降低甚至无效,给治疗病毒性肺炎带来巨大的难题。

中医药具有多环节、多靶点、副作用小的特点治疗呼吸道疾病已有数千年,具有有独特的优势。柴胡-黄芩经典配伍见于小柴胡汤,除此之外,尚有许多柴胡黄芩配伍,如清热解毒的普济消毒饮,辛凉解表、解肌清热的柴葛解肌汤等。早有研究表明[8],柴胡与黄芩配伍不仅能抑制抑制鸡胚内流感病毒,还可降低小鼠病毒性肺炎肺指数和死亡率,具有较好的抗病毒作用。此外,黄锦标[9]在一临床观察中发现,在病毒唑进行抗病毒的基础上联用柴胡和黄芩可有效增强抗病毒的效果。

本研究通过网络药理学分析得出柴胡-黄芩药对可多靶点治疗病毒性肺炎的机制研究。柴胡-黄芩药对治疗主要有53种活性成分、143个靶点和158条生物学信号通路。通过PPI网络分析得出药物靶点与疾病靶点的核心基因包括JUN、MAPK14、FOS、TP53、FOS、TNF、RELA、AKT1、MYC、以及IL-6等关键靶点,柴胡-黄芩通过这些关键靶基因抑制细胞增殖、应激、炎症、功能同步化、凋亡等途径从而发挥病毒性肺炎的作用。通过对GO的分析发现柴胡-黄芩药对主要通过参与病毒性肺炎的氧化应激的反应、活性氧代谢过程、金属离子的反应等治疗病毒性肺炎的分子机制。最后通过KEGG富集分析得出,柴胡-黄芩药对可通过调控AGE-RAGE、IL-17、TNF signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、C-type lectin receptor signaling pathway等信号通路介导的氧化应激、炎症、病毒感染等机制治疗病毒性肺炎。

本研究通过网络药理学初步揭示柴胡-黄芩治疗病毒性肺炎的主要作用靶点以及生物学效应,但由于病毒性肺炎的发病机制尚未明确,柴胡-黄芩药对配伍治疗病毒性肺炎的用药剂量、生物学效应未明确,本研究仅作为理论的探讨性,还需进一步的实验进行验证。

利益冲突说明/Conflict of Intetests

所有作者声明不存在利益冲突。

伦理批准及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本文不涉及伦理批准及均知情同意。