妊娠合并系统性红斑狼疮患者血清miR-21的相对表达水平及临床意义

何小琴,刘玢含,王 英△

1.四川大学华西医院风湿免疫科,四川成都 610041;2.四川大学华西护理学院,四川成都 610041

系统性红斑狼疮(SLE)是一种典型的自身免疫性疾病,其特点是产生自身抗体、沉积免疫复合物而带来多器官功能损害[1]。SLE的临床表现具有异质性,涉及血液、肾脏、神经等系统,使得治疗和管理变得困难和复杂[2]。目前,SLE的诊断主要基于一系列临床表现和实验室指标,如皮肤红斑、关节痛、补体C3、补体C4和抗双链DNA抗体等[3]。由于目前SLE评估方法的复杂性、滞后性和侵袭性,研究人员正在寻找新的遗传生物标志物,以期开发更简单、快速和客观的指标,更准确地预测SLE患者的病情转归和临床结局[2]。

SLE好发于育龄期女性群体,可引起多种不良妊娠结局,如流产、宫内死胎与胎儿发育阻滞等,但经过病情评估、孕前诊断、免疫治疗等措施,妊娠结局可得到改善[4]。因此,寻找能更方便、准确地反映妊娠合并SLE(pSLE)患者疾病活动的指标将为病情控制和妊娠结局改善提供帮助。外泌体可由各种类型的细胞分泌至细胞外并进入循环,其包含的微小RNA(miRNA)可调节受体细胞的基因表达,在细胞间通讯中发挥重要作用,产生局部旁分泌或远端效应,也被认为是重要的生物标志物[5-6]。有研究报道,miRNA在SLE病程发展及早期诊断中具有重要作用[7-8]。本研究采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测pSLE患者血清miRNA(miR)-21的表达水平,将患者其他血液指标与miR-21水平进行相关分析,旨在探究miR-21与pSLE患者病情活动的关系及其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 通过电子病例系统,选取四川大学华西医院(以下简称本院)2021年6月至2023年6月诊断为pSLE的48例患者,将其纳入pSLE组。纳入标准:(1)符合2019年欧洲风湿病联盟与美国风湿病学会关于SLE的分类诊断标准[9];(2)妊娠3～8个月;(3)处于疾病活跃期;(4)入院前未采用其他药物治疗;(5)临床和实验室检查资料完整。排除标准:(1)合并其他慢性疾病;(2)合并其他自身免疫性疾病;(3)其他原因造成器官损害;(4)合并妊娠高血压或妊娠糖尿病。采用SLE疾病活动指数(SLEDAI)-2000对SLEDAI进行评价,根据SLEDAI评分将pSLE组患者分为低活动组(SLEDAI评分为1～9分)和高活动组(SLEDAI评分>9分)。另选取同时期于本院体检的30例健康妊娠期女性作为健康对照组。pSLE组与健康对照组的年龄、体质量指数(BMI)、孕次、文化程度和收入水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性,见表1。本研究获得患者知情同意及本院医学伦理委员会审批通过[23年审(1405)号] 。

1.2方法

1.2.1外泌体及RNA提取 使用美国MCE血清外泌体分离试剂盒分离血清外泌体:抽取所有研究对象清晨空腹静脉血5 mL,将血清置于4 ℃环境下,以3 000×g离心10 min后取上清液,重复2次。取1 mL离心后的上清液,加入3 mL预冷的磷酸盐缓冲液(PBS),再加入1 mL BPS,涡旋,并在4 ℃环境中静置2 h,再以10 000×g离心 60 min,弃上清液,向沉淀物中加入0.5 mL PBS并充分重悬。重悬后的液体以12 000×g 离心2 min后收集上清液,转移至外泌体分离柱中,再以3 000×g 离心10 min并收集柱管底部液体,得到纯化的外泌体。采用天根生化miRcute miRNA提取分离试剂盒进行外泌体提取。根据产品说明书,提取血清外泌体中的miRNA,离心后收集吸附柱底的miRNA,再置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2实时荧光定量PCR检测 采用天根生化miRcute增强型miRNA互补DNA(cDNA)第1链合成试剂盒,按照说明书将提取的miRNA反转录为cDNA,反转录条件为:42 ℃,60 min;95 ℃,3 min。采用天根生化miRcute增强型miRNA荧光定量PCR检测试剂盒,按照产品说明书进行实时荧光定量PCR检测。miR-21正向引物序列为5′-GGGTAGCTTATCAGACTGATGTT-3′,反向引物序列为5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6内参正向引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应参数为95 ℃,15 min;60 ℃,34 s;94 ℃,20 s。共进行40个循环。

1.2.3其他临床指标检测 红细胞沉降率(ESR)采用由意大利Vital Monitor-100全自动ESR仪检测。CRP、补体C3和补体C4分别采用美国Biovision人CRP 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、美国ThermoFisher人补体C3 ELISA试剂盒和美国ThermoFisher人补体 C4 ELISA试剂盒按照产品说明书进行检测。采用上海信裕生物人抗心磷脂-免疫球蛋白(Ig)A抗体(ACA-IgA)ELISA试剂盒,按照说明书对血清ACA水平进行检测。采用广州奥瑞达生物血清循环免疫复合物(CIC)ELISA试剂盒检测CIC水平。

1.2.4器官损害判断 以尿蛋白>0.5 g/24 h为肾脏受损标准;以2个以上关节疼痛并出现炎症反应体征(压痛、肿胀、渗出)为关节受损标准;以溃疡、坏疽、有触痛的手指小结节、甲周微血管病变、裂片形出血或经活检、血管造影证实的血管炎为血管损害标准。统计并比较合并与未合并器官损害pSLE患者的miR-21相对表达水平。

2 结 果

2.1不同组别miR-21相对表达水平比较 低活动组pSLE患者有22例,高活动组pSLE患者有26例,pSLE组miR-21相对表达水平高于健康对照组(1.193±0.181vs.0.913±0.079),差异有统计学意义(t=7.995,P<0.05)。高活动组pSLE患者miR-21相对表达水平高于低活动组(1.258±0.172vs.1.117±0.164),差异有统计学意义(t=2.890,P=0.006)。

2.2健康对照组、高活动组和低活动组其他临床检测指标水平比较 健康对照组、高活动组和低活动组ESR、CRP、补体C3、补体C4、ACA、CIC水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。高活动组和低活动组患者ESR、CRP水平显著高于健康对照组,且高活动组显著高于低活动组,差异均有统计学意义(P<0.05);高活动组和低活动组补体C3、C4水平低于健康对照组,且高活动组低于低活动组,差异均有统计学意义(P<0.05);高活动组患者血清ACA和CIC水平显著高于低活动组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 健康对照组、高活动组和低活动组其他临床检测指标水平比较

2.3合并与未合并器官损害pSLE患者的miR-21相对表达水平比较 有肾脏和关节损害的pSLE患者的miR-21相对表达水平高于无损害患者,差异有统计学意义(P<0.05);合并和未合并血管损害的pSLE患者miR-21相对表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 合并与未合并器官损害pSLE患者的miR-21相对表达水平比较

2.4pSLE患者miR-21相对表达水平与ESR和CRP的相关性分析 Pearson相关分析结果显示,pSLE患者miR-21相对表达水平与ESR、CRP水平呈正相关(r=0.286、0.389,P<0.05),见图1。

注：A表示ESR与miR-21的相关性;B表示CRP与miR-21的相关性。

2.5pSLE患者miR-21相对表达水平与血清免疫学指标的相关性分析 Pearson相关分析结果显示,pSLE患者miR-21相对表达水平与补体C3、C4水平呈负相关(r=-0.346、-0.330,P<0.05),与血清ACA、CIC水平呈正相关(r=0.499、0.326,P<0.05),见图2。

注：A表示补体C3与miR-21的相关性;B表示补体C4与miR-21的相关性;C表示ACA与miR-21的相关性;D表示CIC与miR-21的相关性。

2.6miR-21对pSLE的诊断效能 ROC曲线分析结果显示,miR-21诊断pSLE的曲线下面积(AUC)为0.945(95%CI:0.902～0.989)。当miR-21最佳截断值为1.023时,诊断pSLE的灵敏度为85.4%,特异度为94.0%,见图3。

图3 miR-21诊断pSLE的ROC曲线

3 讨 论

SLE可发生于所有年龄段的女性,尤其好发于育龄女性[4]。SLE本身并不降低女性的生育率,但会对妊娠结局产生影响,可造成母体静脉血栓栓塞及肾损伤,以及流产、早产和胎儿发育阻滞等后果[10]。另一方面,有研究对pSLE患者相关临床指标进行检测发现,通过药物治疗或提前分娩等方式可在很大程度上改善妊娠结局[11]。因此,如何精准预测患者的病情成为目前治疗pSLE的一大问题。本研究结果显示,高活动组和低活动组血清miR-21相对表达水平均高于健康对照组,且高活动组高于低活动组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ESR与CRP是高灵敏的炎症标志物,在pSLE患者中水平升高;补体C3、C4在炎症与免疫应答中发挥重要作用,在pSLE患者中水平下降[12-13]。本研究结果显示,pSLE患者血清miR-21相对表达水平与炎症反应指标ESR和CRP、免疫反应指标ACA、CIC呈正相关(P<0.05),与补体C3、C4呈负相关(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清miR-21诊断pSLE具有较高的灵敏度及特异度。并且,合并肾脏和关节损伤的pSLE患者血清miR-21相对表达水平比未合并肾脏及关节损害的患者高。这些结果表明,血清miR-21的相对表达水平与pSLE患者的疾病活动度和器官累及程度相关,miR-21是评估pSLE患者病情的新的潜在生物标志物。

miRNA已被证实在SLE进展中发挥了重要作用。多种miRNA在SLE患者免疫细胞中表达上调或下调,并参与了T淋巴细胞和B淋巴细胞的异常活化[14]。例如,miR-7可促进SLE患者B淋巴细胞向浆细胞分化,miR-21则引起T淋巴细胞过度活化[15-16]。miRNA表达谱的改变与SLE病情的进展高度相关[7,16]。并且,miRNA表达水平还与SLE相关器官损害程度相关,包括狼疮性肾炎、动脉粥样硬化和心血管损害[17]。因此,血清miRNA可成为评估SLE病情的潜在生物标志物。例如,miR505-3p在SLE患者血浆中表达水平升高并与SLEDAI评分呈正相关,是辅助诊断SLE的潜在生物标志物[18]。但miRNA在评估pSLE患者的诊断效能的报道较少。另一方面,血液中裸露的miRNA在RNA酶的作用下往往快速降解,使其直接分离,导致检测血清miRNA的灵敏度和特异度较低。

外泌体是一种直径介于30～150 nm的球形脂质囊泡,其内包含蛋白质和miRNA等生物活性物质,广泛参与多种疾病的发展过程,并因其可进入血液循环而成为潜在的理想监测靶标。外泌体已被证明在SLE疾病进展中发挥了重要作用[19]。现有证据表明,循环外泌体的水平与SLE的疾病活动显著相关[20]。人体尿液、血清和唾液中的细胞外miRNA多数集中在外泌体中,使得它们在脂质双分子层的保护下不被RNA酶降解[7]。miRNA不仅在SLE发展中发挥了重要作用,还是一种诊断pSLE的潜在生物标志物[7]。因此,分离纯化并检测体液中的miRNA相对表达水平,是评估pSLE病情进展的一种高灵敏手段。

已有证据表明,血清miRNA含有多种疾病的指纹图谱,并能够将SLE从其他炎症疾病中辨别出来,使得体液中miRNA成为潜在诊断SLE的生物标志物,另外,miR-21在SLE患者中呈高水平表达并与SLEDAI评分呈正相关,在活跃和非活跃SLE患者中呈现出表达差异,在病情缓解患者血液中表达下降[21]。最新的研究显示,抑制miR-21相对表达水平可显著改善狼疮表型,包括皮肤损害和狼疮性肾炎[22]。这些结果使得miR-21成为预测SLE疾病进展的一项潜在生物标志物,但其在pSLE患者中的表达和作用前期报道较少。

本研究结果显示,血清miR-21可较好地用于评估pSLE患者临床疾病活动和器官损害,并对pSLE患者具有较高的诊断灵敏度和特异度。因此,血清miR-21可作为评估pSLE患者病情的潜在生物标志物,有助于更精确地评估和预测病情进展,为及时采取措施改善病情和妊娠结局提供依据。