酶解血粉制备氨基酸水溶肥工艺条件优化

张洪志，沈 涛，杜新园，杨育乾

（宁夏夏盛实业集团有限公司，宁夏 银川 750000）

我国是畜禽养殖大国，2019 年我国猪、牛、羊肉产量为8 363 万t，屠宰加工过程中产生近50%的废弃物，其中血液占30%左右。除作为工业原料及蛋白饲料外，大部分血液作为废弃物被排放，导致环境污染和资源浪费［1］。利用动物血液生产氨基酸水溶肥是变废为宝的途径之一。氨基酸是目前农资市场中使用量较大的一种生物刺激素，可以作为一种有机氮源为植物代谢过程提供氮素，作为结构性分子用于合成蛋白质大分子，另外可以作为功能性分子参与植物各种生理活动［2］。丁恒毅［3］发现氨基酸肥料可以提升茶叶品质，增加茶叶中茶多酚、氨基酸、咖啡因等的含量，同时增强茶叶的口感；周辉轩等［4］研究发现，在桃树幼苗期喷施氨基酸水溶肥能够显著促进幼苗的生长发育。蛋白多肽是一种新型的植物激素，其分子量比蛋白质更小，可以直接被植物吸收利用，叶面喷施蛋白多肽能促进植物干物质的积累，增强植物光合作用［5］，促进土壤微生物种群增加，有利于植物对钾、钙、镁、铁、钠等元素的吸收［6］。

目前，国内对利用商业化蛋白酶酶解动物血液制备氨基酸水溶肥的研究较少，且主要集中在动物血液废弃物分解菌的筛选和鉴定等方面的基础研究。周毅等［7］对生猪屠宰场下水道土壤中的微生物进行分离，获得一株产酶能力较高的菌株B12，所产蛋白酶活力最高可达185.58 U/mL；周雪雁等［8］以屠宰场废弃血液堆积处土壤样品为材料，获得了能够有效降解废弃血液的功能菌株，其蛋白酶活力为188.63 U/mL；蔡艺菲等［9］以猪血为原料，利用风味蛋白酶水解猪血中的蛋白质，在液料体积质量比10.5 mL/g、pH 6、水解温度50 ℃、每克蛋白酶活力为12 000 U、水解时间7 h的条件下，蛋白水解度为40.42%。

利用商业化蛋白酶水解血液制备氨基酸水溶肥的研究虽有报道，但是蛋白水解度不高，氨基酸产率低。本实验利用组合蛋白酶探究酶解参数对酶解效果的影响，提高血粉蛋白的水解度，增加酶解液中氨基酸含量，为蛋白酶酶解血液制备氨基酸水溶肥的过程控制及规模化应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

干燥血粉（血液喷雾干燥制成），由青岛中科兴海生物科技有限公司提供，w（蛋白质）87.5%。

蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C（均由枯草芽孢杆菌表达，水解度不同），以及胰蛋白酶、风味蛋白酶5 种蛋白酶均由宁夏夏盛实业集团有限公司生产；甲醛、氢氧化钠、盐酸、无水硫酸铜、三氯乙酸、硼酸、硫酸，均为国产分析纯；19 种氨基酸混合标准溶液，由北京索莱宝科技有限公司生产；乙腈、亮氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（多肽分析所用标准品）、血管紧张素Ⅱ、阿太地尔、细胞色素C，由上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 血粉酶解工艺

将血粉与纯化水按照一定比例混合后，用氢氧化钠溶液调节料液pH，加入一定量的蛋白酶，在规定的温度下恒温搅拌酶解一定时间，酶解结束后于90 ℃水浴锅中灭酶15 min，冷却，测定蛋白水解度、酶解液氨基酸含量等指标。分别考察液料比、原料预处理温度、蛋白酶种类及组合酶比例对血粉酶解效果的影响。

1.2.2 组合酶水解工艺

在确定组合酶比例的基础上进一步优化血粉酶解工艺，以温度、酶制剂添加量、pH 和时间为因素，以血粉蛋白水解度为指标，采用L9（34）正交实验优化组合酶水解血粉工艺。正交实验因素水平设计见表1。

表1 L9（34）正交实验因素水平

1.3 分析检测

总氮含量测定：参照GB 5009.5—2016，采用凯氏定氮法测定［10］。

水解度测定：称取酶解液4 g 置于10 mL 离心管中，再加入质量分数15%的三氯乙酸溶液4 mL，振荡至均一，然后静置30 min，再在转速8 000 r/min的离心机中离心10 min。称量上清液，并测定其总氮含量，计算水解度（水解度=上清液中总氮质量/酶解液中总氮质量）。

氨基酸含量测定：参照NY/T 1975—2010，采用柱前衍生-液相色谱仪法测定［11］。

多肽分布测定：参照GB/T 22492—2008，采用高效凝胶过滤色谱法测定［12］。

1.4 数据处理

正交实验分析由SPSS V17 完成；图由Origin 8.0（美国OriginLab公司）绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 液料比对血粉酶解效果的影响

在蛋白酶C 添加量为1.0%、pH 为7.0、时间为8 h、温度为50 ℃的条件下，研究液料比对血粉酶解效果的影响，结果见图1。

图1 液料比对血粉酶解效果的影响

由图1a.可知，随着血粉浓度降低，料液中蛋白质含量不断下降。由图1b.可知，当液料体积质量比在4～6 mL/g 范围内，血粉蛋白质的水解度随着血粉浓度降低而增加；液料体积质量比在6～8 mL/g范围内，血粉蛋白质的水解度随血粉浓度降低而降低。因此，选择6 mL/g作为较佳的液料体积质量比（后续实验液料体积质量比均为6 mL/g），此时料液中w（蛋白质）为12.50%。该实验结果与复合蛋白酶在不同液料比条件下水解效果基本一致［13］。在酶促反应过程中，不同的底物浓度对酶制剂的酶解效果具有显著影响［14］。研究表明，在一定范围内，随着底物浓度不断增加，酶与底物结合达到饱和，底物浓度增加反应效率不再提高［15］，反而因底物浓度过大，降低酶在溶液中的扩散能力，而且过量底物可能通过分子间作用力与酶结合形成中间产物，抑制酶解反应的进行，使得蛋白水解度降低［16］。

2.1.2 原料预处理温度对血粉酶解效果的影响

在蛋白酶C 添加量为1.0%、pH 为7.0、时间为8 h、温度为50 ℃的条件下，探究了在不同预处理温度下加热10 min对血粉酶解效果的影响，结果见图2。

图2 原料预处理温度对血粉酶解效果的影响

由图2 可知，对照组（常温）血粉蛋白水解度及酶解液w（氨基酸）分别为44.57%和3.41%；当预处理温度为70、75 ℃时，血粉蛋白水解度及酶解液氨基酸含量结果与对照组相当；当预处理温度为80～90 ℃时，血粉蛋白水解度及酶解液氨基酸含量有所增加，处理温度为90 ℃时提高幅度最大，血粉蛋白水解度及酶解液w（氨基酸） 分别为46.13%和3.64%。

蛋白质在变性过程中，维系其空间结构的次级键被破坏，原有空间结构解体，分子由紧密球形结构变为松散的无特定空间结构的链状［17］。原料在酶解前，通过物理加热手段使蛋白质适当变性，释放酶切位点，为后续高效酶解提供基础［18］，热处理能破坏蛋白质的二级、三级或四级结构，打开氢键、S—S 键及疏水键，使多肽链完全展开；由于分子结构松散，那些原来包藏在分子内部的易与酶发生作用的部位暴露出来，从而使蛋白水解酶的作用点大大增加，提高酶解速度；但若加热过度，松散的多肽链又会由于S—S 键和疏水键的再生而结合更加紧密，反而阻碍酶对蛋白的水解作用［19］。刘元林［20］研究发现，对碱性蛋白酶而言，仅低温短时预处理（75 ℃，5 min）可促进蛋白水解；对风味蛋白酶而言，除低温长时预处理（75 ℃，15 min）蛋白水解度与空白组无显著性差异外，其他处理水解度都显著低于空白组。张婷等［21］利用多元线性回归法优化出最佳热变性条件，w（血红蛋白）5%时40 ℃热变处理2.5 h 后，酶解血红蛋白制备亚铁血红素产率达到10.42 mg/mL，较未经热变性处理提高了30.02%。

根据本研究结果可知，在一定温度范围内，随着预处理温度升高，血粉酶解效果有所提升，但是提升幅度不大，没有显著促进效果。在加热过程中血块熟化，完全失去流动性，不利于酶与蛋白接触，并且会沾到容器壁，对设备搅拌功能要求较高，同时成本会上升。因此，不建议对原料进行热变性处理。

2.1.3 蛋白酶种类对血粉酶解效果的影响

在蛋白酶添加量为1.0%、pH 为7.0、时间为8 h、温度为50 ℃的条件下，研究蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、胰蛋白酶、风味蛋白酶对血粉酶解效果的影响，结果见图3。

图3 蛋白酶种类对血粉酶解效果的影响

由图3 可以看出，蛋白酶B 的水解效果最好，血粉蛋白水解度为49.36%，酶解液中w（氨基酸）为3.95%；与其他蛋白酶相比，风味蛋白酶在对血粉蛋白水解上表现一般，但是在提高酶解液中氨基酸含量上具有较明显的作用，w（氨基酸）高达4.02%。风味蛋白酶主要以外切酶为主，在对蛋白质进行水解的同时，可以从多肽末端切下更多的氨基酸。因此，选择蛋白酶B 和风味蛋白酶组合进行酶解研究。在酶促反应过程中，酶具有专一性，不同蛋白酶对蛋白质的酶切位点不一样，因此蛋白酶的选择对血粉的酶解效率至关重要［22］。组合酶的使用对提高蛋白质水解度，得到高质量产物有非常重要的意义，内切酶对提高水解度效果较理想，外切酶能将氨基端的氨基酸水解为游离氨基酸［23］。刘成梅等［24］建立中性蛋白酶和风味蛋白酶同步酶解鸭血蛋白工艺，得到的小分子肽无异味且苦味轻；江霞等［25］采用风味蛋白酶与胰酶同步添加酶解工艺，提高了猪血蛋白水解度，获得更加丰富的小分子肽及游离氨基酸产物；于美娟等［26］研究结果表明，组合酶水解猪血红蛋白效果优于单一酶水解效果，弥补了两种酶单独酶解时的不足。

2.1.4 组合酶比例对血粉酶解效果的影响

在蛋白酶添加总量为1.0%、pH 为7.0、时间为8 h、温度为50 ℃的条件下，研究蛋白酶B 和风味蛋白酶质量比对血粉酶解效果的影响，结果见图4。

图4 m（蛋白酶B）∶m（风味蛋白酶）对血粉酶解效果的影响

由图4 可以看出，一开始随着风味蛋白酶占比提高，组合酶对血粉的水解效果提升，但随着风味蛋白酶占比进一步提升，组合酶对血粉的水解效果反而下降。因此选择m（蛋白酶B）∶m（风味蛋白酶）为2 ∶1进行后续研究。

2.2 组合酶水解血粉正交实验结果

为提高血粉蛋白酶水解度，增加酶解液中氨基酸含量，在m（蛋白酶B）∶m（风味蛋白酶）为2∶1 的条件下，以温度、酶制剂添加量、pH 和时间为因素，以血粉蛋白水解度为指标，正交实验结果见表2。

表2 组合酶L9（34）正交实验结果

由表2 可知，温度对血粉蛋白酶解产生主要作用，其次是组合酶添加量、pH和时间。较佳酶解工艺参数为温度55 ℃、组合酶添加量3.0%、pH 8.0、时间12 h，此时血粉蛋白水解度为67.26%。

2.3 血粉酶解液中游离氨基酸分析

采用液相色谱仪检测最佳酶解条件下的酶解液中氨基酸种类与质量分数，结果见表3。

表3 最佳酶解条件下血粉酶解液中氨基酸检测结果

由表3可知，血粉酶解液中共含有19种游离氨基酸。经计算，游离氨基酸总质量分数为6.39%，占总蛋白质的51.12%（酶解液中总蛋白质质量分数为12.50%）。酶解液中丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和赖氨酸的质量分数均在0.50%以上，苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的质量分数均在0.30%以上。尤其是亮氨酸的质量分数高达0.79%，占料液总蛋白质的6.32%。

2.4 血粉酶解液中多肽分析

采用液相色谱仪检测最佳酶解条件下所得酶解液中多肽分布，混合多肽标样色谱图及酶解液中多肽分布色谱图分别见图5、图6，酶解液中多肽分子量分布见表4。

图5 混合多肽标样液相色谱图

图6 酶解液中多肽分布液相色谱图

表4 酶解液中多肽分子量分布

由图6 及表4 可知，酶解液中多肽分子量在1 046 Da 以下的占比达到99.59%，其中多肽分子量在451～1 046 Da 的占比为3.66%，在131～＜451 Da 的占比为35.77%，分子量小于131 Da 的产物（小肽、氨基酸等）占比达60.17%。

3 结论

血粉的最佳酶解工艺为液料体积质量比6 mL/g、温度55 ℃、组合酶添加量3.0%、pH 8.0、时间12 h，其中组合酶中蛋白酶B与风味蛋白酶质量比为2∶1。在该工艺条件下，血粉蛋白水解度为67.26%，酶解液中19种游离氨基酸总质量分数为6.39%，分子量在1 046 Da以下的多肽占比达到99.59%。通过对血粉酶解工艺的优化，提高了血粉蛋白的水解度，增加酶解液中氨基酸含量。该酶解工艺时间短，效率高，操作简单，易于工厂大规模生产，为蛋白酶酶解血液制备氨基酸水溶肥的过程控制及规模应用提供理论指导。