麻石清肺合剂HPLC指纹图谱的建立及7种成分含量测定

王博，吴茱萸，裴媛，于晓涛，王瑞（漯河市中心医院，河南 漯河 462000）

麻石清肺合剂来源于《伤寒论》“麻杏石甘汤”[1]，由麻黄、厚朴、甘草、苦杏仁等中药组成，具有清肺热、化浊痰的功效，主要用于肺炎、慢性支气管炎等肺病患者痰热郁肺证。中药饮片由于产地不同、炮制加工方式不同等多方面因素的影响，导致品质参差不齐[2]。中药复方制剂受制剂生产多个环节的影响，加之其本身成分的复杂性，其质量的均一稳定直接影响药效，因此对其进行整体质量控制尤为重要[3]。指纹图谱能够对中药及中药复方中化学成分进行系统、整体的表征，呈现专属性强、稳定性高等特点[4]，在中药材、饮片及复方制剂的品质评价中得到了广泛应用[5-7]。结合化学模式识别，可以简化数据结构，更加直观深入地评判样本的质量，筛选差异化合物[8]。本文将通过HPLC法建立麻石清肺合剂指纹图谱，联合聚类分析等多元统计方法对其进行分析，同时测定麻石清肺样品中盐酸麻黄碱等7种成分的含量，为麻石清肺合剂全方位的品质评价提供基础。

1 材料

1.1 仪器

HPLC色谱仪（Agilent科技公司，1260型），电子天平（日本岛津公司，AUW-120D型），CJ-020S型超声机（深圳市超洁有限公司），超纯水过滤系统（密理博公司）。

1.2 试药

对照品盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、甘草苷、和厚朴酚、厚朴酚（中国食品药品检定研究院，批号分别为171241-201809、171237-201510、111610-201908、110730-201915、110729-202015，纯度均大于95%），苦杏仁苷（批号为DST190829-004）、甘草酸（批号为MUST-19052407）（纯度均大于98%，成都曼思特公司）。乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；磷酸（色谱纯，天津科密欧公司）；水为自制超纯水。

12批麻石清肺合剂为漯河市中心医院自制（批号分别为20220120、20220217、20220314、20220407、20220428、20220518、20220613、20220705、20220801、20220906、20220929、20221018，编号S1～S12）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.1%磷酸-水溶液，B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长210 nm；流速1.0 mL·min－1；柱温30℃；进样量5 μL。

表1 梯度洗脱方法Tab 1 Gradient elution method

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取各对照品适量，加50%甲醇分别配制成盐酸麻黄碱292.600 μg·mL－1、盐酸伪麻黄碱175.480 μg·mL－1、苦杏仁苷1248.000 μg·mL－1、甘草苷192.000 μg·mL－1、甘草酸298.080 μg·mL－1、和厚朴酚14.826 μg·mL－1、厚朴酚25.338 μg·mL－1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取麻石清肺合剂100 μL，加80%甲醇900 μL稀释10倍，摇匀后用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按麻石清肺合剂处方工艺制备缺麻黄、厚朴、苦杏仁、甘草的阴性样品，并稀释10倍制备阴性样品溶液。

2.3 麻石清肺合剂HPLC指纹图谱的建立

2.3.1 方法学考察 取S1麻石清肺样品100 μL制备成供试品溶液，连续6次进样考察精密度；平行制备6份麻石清肺样品S1供试品溶液，进样检测考察重复性；取麻石清肺样品S1供试品溶液，放置0、3、6、9、12、24 h分别进样测定，考察样品24 h内稳定性。结果精密度试验、重复性试验、稳定性试验得到的各共有峰相对保留时间RSD均小于1.8%，相对峰面积RSD均小于3.0%。

2.3.2 指纹图谱的构建 取12批麻石清肺合剂供试品溶液，进样检测并采集数据。运用2012版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》以S1样品为参照图谱，生成对照指纹图谱，见图1，共标定16个共有峰。得到样品S1～S12的相似度分别为0.982、0.900、0.986、0.992、0.976、0.937、0.968、0.980、0.989、0.975、0.979、0.991。

图1 12批麻石清肺合剂的HPLC指纹图谱Fig 1 HPLC fingerprints of 12 batches of Mashi Qingfei mixture

2.4 化学模式识别分析

2.4.1 聚类分析 将12批麻石清肺合剂的16个共有峰数据导入SPSS 25.0软件，采用组间联结法聚类分析，以平方欧氏距离为区间，见图2。当平方欧氏距离为10时12批样品分为4类，第1类为S2，第2类为S5、S6，第3类为S3、S12，第4类为S1、S4、S7～11。

图2 麻石清肺合剂样品聚类分析树状图Fig 2 Mashi Qingfei mixture sample clustering analysis

2.4.2 主成分分析 对12批麻石清肺合剂中16个共有峰数据采用SPSS 25.0软件进行因子分析。结果见表2，有4个主成分的特征值大于1，方差贡献率累计达到85.6%，表明其包含了85.6%的色谱图信息。峰2、5～7、9、13在主成分1上具有较高的载荷（分别为0.812、0.768、0.875、0.807、0.791、0.750），其代表了主成分1的主要信息；主成分2主要代表了峰1、15、16（分别为0.787、0.967、0.941）；主成分3主要代表了峰3、4、11、12（分别为0.923、0.928、0.513、0.679）；主成分4主要代表了峰8、10、14（分别为0.766、0.880、0.850）。

表2 12批麻石清肺合剂中的主成分特征值及方差贡献率Tab 2 Characteristic value and contribution rate of 12 batches of Mashi Qingfei mixture

2.4.3 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）以12批麻石清肺合剂中16个共有峰峰面积为变量，构建12×16的原始数据矩阵，采用SIMCA 14.1软件进行OPLS-DA分析，结果见图3、4。8、7（苦杏仁苷）、3（盐酸麻黄碱）、9、10（甘草苷）、4（盐酸伪麻黄碱）、6号峰的VIP值均大于1.0，这7种成分可能为麻石清肺样品的差异性成分。

图3 正交偏最小二乘判别分析得分矩阵图Fig 3 OPLS-DA score plot

图4 麻石清肺合剂样品中16个共有峰的VIP图Fig 4 VIP of 16 common peaks of Mashi Qingfei mixture

2.5 多成分含量测定

2.5.1 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.1%磷酸-水溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序见表3；流速1.0 mL·min－1；柱温30℃；进样量5 μL。检测波长：0～47 min，210 nm（盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷）；47～75 min，237 nm（甘草苷）；75～95 min，251 nm（甘草酸）；95～125 min，210 nm（和厚朴酚、厚朴酚）。

表3 梯度洗脱方法Tab 3 Gradient elution method

2.5.2 专属性考察 取混合对照品溶液、S1供试品溶液、阴性样品溶液适量进样，得到各色谱图见图5，结果显示阴性样品不干扰样品中7种成分的测定。

图5 对照品溶液、S1供试品溶液和阴性样品溶液（缺麻黄、苦杏仁、甘草、厚朴）色谱图Fig 5 HPLC chromatograms of reference solution，S1 sample solution and negative sample solution（without Ephedrae Herba，Armeniacae Semen Amarum，Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma，or Magnoliae Officinalis Cortex）

2.5.3 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，分别用50%甲醇稀释成系列对照品溶液，进样并记录各浓度下色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y）、各成分的质量浓度为横坐标（X）进行线性拟合。同时测定盐酸麻黄碱等7种成分的定量限[LOQ，信噪比（S/N）＝10]和检测限（LOD，S/N＝3），结果见表4。

表4 7种成分的回归方程与线性范围Tab 4 Regressive equations and linear ranges of 7 components

2.5.4 方法学考察 用50%甲醇稀释“2.2.1”项下混合对照品溶液，稀释5倍后连续进样6次考察仪器精密度。取S1样品溶液6份，平行制备成供试品溶液，进样测定，并计算7种成分含量考察方法重复性。取S1样品溶液，制备后于0、2、4、8、12、24 h进样测定考察稳定性。取S1样品溶液6份，精密加入含盐酸麻黄碱63.840 μg·mL－1、盐酸伪麻黄碱35.096 μg·mL－1、苦杏仁苷265.600 μg·mL－1、甘草苷38.400 μg·mL－1、甘草酸57.960 μg·mL－1、和厚朴酚3.163 μg·mL－1、厚朴酚5.562 μg·mL－1的混合对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备，进样测定，计算回收率。结果精密度试验中7种成分的峰面积RSD均在1.0%～1.3%；重复性试验中7种成分含量的RSD均在0.49%～2.8%；稳定性试验中7种成分峰面积的RSD均在1.2%～2.8%。7种成分的平均加样回收率为98.12%～101.55%，RSD为1.8%～2.9%。

2.5.5 含量测定 取12批麻石清肺合剂样品，制备成供试品溶液进样，并计算12批样品中各成分的含量，结果见表5。

表5 7种成分的含量测定结果(n＝3，μg·mL－1)Tab 5 Content of 7 components (n＝3，μg·mL－1)

3 讨论

本研究考察了水、甲醇、80%甲醇等不同类型提取溶剂对样品的影响，发现80%甲醇为提取溶剂时色谱峰响应较大、峰数较多。考察了Inertsil ODS-3 C18、Shimadzu shim-pack GIST C18、Agilent ZORBAX SB C18不同色谱柱，结果显示Agilent ZORBAX SB C18色谱柱峰形最好。比较210、230、254、280 nm不同检测波长，发现样品在210 nm下出峰数目最多，故选择指纹图谱的检测波长为210 nm，同时在多成分含量测定方法中分别选择化合物各自的最大吸收波长，盐酸麻黄碱、和厚朴酚、盐酸伪麻黄碱、厚朴酚、苦杏仁苷为210 nm，甘草苷为237 nm，甘草酸为251 nm，多波长切换进行检测。同时由于指纹图谱在210 nm下色谱峰较多，因此其色谱条件梯度变化较缓，时间较长，考虑到后续的多成分含量测定需进行方法学考察及样品含量的测定，为节约分析时间，在保证7种成分分离度的前提下对色谱条件的梯度进行了调整。

本研究建立了12批麻石清肺合剂的指纹图谱，相似度以对照指纹图谱为参考在0.900～0.992，表明这12批样品质量相对稳定。结合聚类分析、OPLS-DA等化学计量学方法对其进行分析，结果不同批次样品呈现一定的差异，筛选出7个共有峰VIP值大于1，分别为8、7（苦杏仁苷）、3（盐酸麻黄碱）、9、10（甘草苷）、4（盐酸伪麻黄碱）、6号峰。本方中麻黄指标成分为盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱，具有止咳平喘、抗病毒、抗炎等功效[9-10]；苦杏仁中主要成分为苦杏仁苷，在体内缓慢分解为氢氰酸，从而舒张支气管平滑肌，发挥止咳平喘的作用[11]；甘草中的甘草苷、甘草酸抗病毒、抗肿瘤、免疫保护等活性较强[12-13]；厚朴中的和厚朴酚、厚朴酚具有肠道保护、抗病毒等作用[14-15]；依据本方君臣佐使配伍原理及主要药效成分选择此7种成分进行定量。12批麻石清肺合剂的含量测定结果表明不同批次间7种成分含量存在一定的差异，考虑到与所用饮片产地、批次、厂家、制剂加工等因素有关，提示在今后的生产中可以固定饮片产地、厂家，控制生产参数等因素的影响，以保证制剂质量的均一稳定。

综上所述，本研究所建立的指纹图谱和含量测定方法稳定可行，联合模式识别可为麻石清肺合剂的质量评价提供依据。