药用植物内生菌促药效成分生物合成的研究进展

曹际钊，都晓伟，李倩，国立东，于丹（黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 150040）

植物内生菌是指存活于植物内部，又不会引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物类群，主要为真菌、细菌和放线菌[1]。药用植物内生菌不仅能够促进寄主植物的生长，增强寄主植物对各种病原菌和环境胁迫的抗性，还能促进宿主植物化学成分的合成或产生与宿主相同或相似的化学成分[2]，或者对化学成分进行结构修饰，增强其药理活性[3]。1993年，Stierle等[4]首次从短叶紫杉的树皮中分离得到一株能够产生抗肿瘤活性物质紫杉醇的内生真菌安德氏紫杉霉（Taxomyces andreanae），这为生产紫杉醇提供了途径，从而引发了药用植物内生菌的研究热潮。药用植物内生菌现已成为获取活性成分的新宝库[5]。

本文归纳总结了现已报道的药用植物内生菌种类及其促进药用植物活性成分生物合成的途径，包括直接合成生物活性物质、诱导子效应和生物转化作用，为促进药用植物内生菌的应用和提升生药材质量提供参考。

1 药用植物内生菌种类

内生菌与宿主植物长期进化、共生，形成了稳定的互利关系[6]。来源于内生细菌、内生真菌和内生放线菌的许多菌种均具有代谢产生与宿主相同或相似的活性成分，或促进宿主植物活性成分生物合成，或对宿主植物化学成分进行结构修饰的作用。

1.1 内生真菌

药用植物内生真菌多来源于双核菌门子囊菌亚门中的核菌纲、盘菌纲和腔菌纲[7]。根据内生真菌与宿主间的专一性分析，自然界至少有100多万种内生真菌[8]。研究人员总结了国内外药用植物内生真菌的种类，从83科212种药用植物的根、茎、叶、花、果实和叶柄中分离得到的内生真菌多达376属，涉及子囊菌、担子菌和无孢类群等。其中子囊菌为植物内生真菌的优势种群，有372属，例如镰刀菌属、链格孢属、青霉菌属、毛壳菌属、木霉属和拟茎点霉属等，以镰刀菌属真菌的数量最多，现已发现其寄生于100余种药用植物中[9]。从盾叶薯蓣中分离获得的一株内生尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum），利用其灭活菌丝处理盾叶薯蓣的无菌苗可以提高薯蓣皂苷元的含量[10]。来自于链格孢属真菌的植物内生真菌也较为多见，从黄芪中分离获得的一株内生链格孢菌Alternariaeureka20131E1BL1可以修饰环黄芪醇和黄芪醇的结构，生成具有端粒酶抑制作用的新化合物[11]。Kaur等[12]研究发现牛角瓜内生真菌Allternariadestruens代谢生成的酚类化合物AF1和AF2，既可以抗菌又可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性，这使其可能在糖尿病的治疗中获得应用。

1.2 内生细菌

药用植物内生细菌主要来源于芽孢杆菌目、肠杆菌目和假单胞菌目，在这些目中，又以来源于芽孢杆菌属、泛菌属和假单胞菌属的细菌最为常见[13]。现已发现药用植物内生细菌可以促进枯草菌脂肽钠、伊枯草菌素、丰原素等的生物合成[14]。周佳宇[15]研究显示，内生细菌荧光假单胞菌（P.fluorescens）侵染茅苍术后，茅苍术体内含氧倍半萜含量增加，挥发性成分苍术醇、β-桉叶醇和苍术酮的积累也显著提升。不动杆菌（Acinetobacter）是分离自苍术的另一种内生细菌，其可以通过诱导植物内源激素分子的合成，促进苍术挥发油的积累，苍术醇、苍术酮和苍术素等主要挥发性化学成分的含量均有所提高[16]。Song等[17]研究发现人参内生细菌芽孢杆菌属LB5-3诱导人参不定根6 d后，人参总皂苷的含量增加了3倍。

1.3 内生放线菌

在内生菌研究初期，有关内生放线菌的研究较少，直到1999年Caruso等[18]从欧洲红豆杉（TaxusbaccataL.）中分离得到多株能够自主产生紫杉烷类物质的内生放线菌菌株，尤其是北里孢菌（Kitasatospora），可以完全依靠自身产生紫杉醇，这一发现使得内生放线菌备受关注。

迄今为止，已从药用植物中发现了140多个放线菌属，主要为链霉菌属（Streptomyces）、链轮丝菌属（Streptoverticillum）、游动放线菌属（Antinoplanes）、链孢子囊菌属（Streptosporangium）、诺氏卡菌属（Nocardia）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）和小单胞菌属（Micromonospora）等[19]。药用植物内生放线菌能产生包括多肽、有机酸、生物碱、醌、萜类等在内的多种次级代谢产物[20-21]。

内生放线菌还可以促进宿主植物生成活性成分。Li等[22]发现一株黄花蒿内生放线菌假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）YIM 63111，其可以通过上调黄花蒿中编码紫穗槐二烯氧化酶（CYP71AV1）和细胞色素P450还原酶（CPR）基因的表达，从而提高黄花蒿中青蒿素的产量。Zhou等[23]从益智中分离出一株放线菌链霉菌属YIM66017，发现其可显著提高宿主中2，6-二甲氧基对苯二甲酸、cyclo（Gly-Trp）和具有较强抗氧化性的α-羟基乙酰香草酮的含量。

代表性促进活性成分合成的药用植物内生真菌，内生细菌及内生放线菌见表1。

表1 代表性促进活性成分合成的药用植物内生菌Tab 1 Representative endophytes from medicinal plants in promoting the biosynthesis of active substances

2 药用植物内生菌促活性成分生物合成途径

药用植物内生菌促活性成分生物合成的途径主要包括：① 内生菌直接合成与宿主植物相同的活性成分；② 通过诱导子效应改变宿主植物的基因表达和代谢途径；③ 通过生物转化作用对植物化学成分进行结构修饰与改造或提高活性成分的含量。

2.1 内生菌直接合成活性成分或其前体物质

目前已有报道，内生菌能通过自身代谢生成紫杉醇[25]、喜树碱[32]等多种活性化合物，或者以合成的次生代谢产物作为前体物再通过宿主植物的合成酶系催化生成活性成分，进而影响宿主的次生代谢积累[68]。研究表明，可直接合成活性成分的药用植物内生菌基本都可以在仅提供菌体生存必要成分的培养基中产生活性成分，并且不必依赖于宿主植物的存在，但若想提高产量还需要增加碳源氮源以及与宿主植物中相同的一些前体物质等[32，69]。

2.1.1 内生真菌直接合成活性成分 可直接合成药用植物活性成分的内生真菌常见于镰刀菌属、链格孢属、曲霉属等。Kumar等[25]从红豆杉中分离到可产生紫杉醇的内生烟曲霉（Aspergillus fumigatus），其液体培养基中的紫杉醇含量可达1.6 g·L－1，是目前能够代谢生成紫杉醇的微生物中最高的。从喜树中分离筛选得到的一株内生链格孢属Alternariasp.菌株，其发酵液中喜树碱含量可达227 μg·L－1[70]。从柴龙树中分离得到的内生真菌FusariumsolaniMTCC9667和MTCC9668，两者均能产生喜树碱，并且还可以产生9-甲氧基喜树碱和10-羟喜树碱[32]。研究人员从千层塔中分离到一株可产生石杉碱甲的内生真菌胶孢炭疽菌，基因组和转录组分析显示该菌株的聚酮合酶相关基因对石杉碱甲的积累有重要作用[30]。

某些内生真菌活性成分的生成必须依赖于宿主植物。例如，从喜树树皮组织中分离出的一株腐皮镰孢菌（Fusariumsolani），在体外培养条件下其产生喜树碱的能力随着传代次数增加而逐渐下降，优化发酵条件和添加前体物质均不能恢复其合成喜树碱的能力，但进一步研究发现这株内生真菌能够自行合成喜树碱的前体物质β-吲哚基乙胺，然后借助宿主植物中的异胡豆苷合成酶合成喜树碱[68]。

2.1.2 内生细菌直接合成活性成分 目前，有关内生细菌直接合成皂苷类化合物的研究相对较多，如三萜皂苷、甾体皂苷等。例如，分离自人参的一株内生嗜气芽孢杆菌（Bacillusaerophilus）PD17-15，其可通过自身代谢产生稀有人参皂苷F2[69]。同样分离自人参的一株内生细菌农杆菌属（Agrobacterium）PDA-2，其液体培养基中的稀有人参皂苷Rg3和Rh2含量分别达到62.20 mg·L－1和18.60 mg·L－1[71]。金护定[72]从人参中分离得到81种人参内生菌，从中筛选得到3株具有较强产皂苷能力的菌株，分别为2株节杆菌属（Arthrobactersp.）LB-2和R2A-2，以及1株毛根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）PDA-2，其中菌株LB-2可以产生人参皂苷F2、人参皂苷Rh2和原人参二醇PPD，而菌株R2A-2除了可以产生上述三种人参皂苷外，还可以产生人参皂苷Rb1，菌株PDA-2可以产生人参皂苷F2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh2和原人参二醇PPD。

重楼甾体皂苷具有显著的抗肿瘤活性，赵明等[47]从华重楼中分离到的内生细菌西地西菌属（Cedeceadavisae）SS01和类芽孢杆菌属（Paenibacillusdaejeonensis）SS02均能产生重楼甾体皂苷类化学成分。甾体皂苷是襄麦冬的主要活性成分之一，余海忠等[73]从不同生长时期的襄麦冬块根和须根中分离获得50株内生细菌，后经纯培技术筛选出3株具有明显产甾体皂苷能力的内生细菌，分别为墨西哥假黄单胞菌（Pseudoxanthomonasmexicana）、山羊葡萄球菌（Staphylococcuscaprae）和砖红色微杆菌（Microbacteriumtestaceum）。

2.1.3 内生放线菌直接合成活性成分 与内生真菌和内生细菌相似，内生放线菌也具有产生与宿主植物相同活性成分的能力，但研究报道相对较少。Caruso等[18]从欧洲红豆杉中分离得到多株能够自主产生紫杉烷类物质的内生放线菌菌株，其中北里孢菌（Kitasatospora）自身就能够合成紫杉醇。分离自银桦的内生放线菌Streptomycessp.NRRL 30566可代谢生成kakadumycin，其是一种多肽抗菌药物，对革兰氏阳性菌具有很强的抗菌活性，同时对RNA合成酶也表现出抑制活性[74]。

2.2 内生菌介导的诱导子效应

诱导子是能够诱导植物细胞出现一种或几种反应，并激发植物特征性自身防御反应的分子。植物能够通过化学识别系统检测到诱导子，触发自身产生信号转导，进而引起反应应答，导致某些次生代谢物的积累[75]。内生菌作为药用植物环境的重要组成部分，可起到诱导子的作用，与药用植物形成长期稳定、互惠互利的共生关系[15，76]。内生菌诱导子几乎全部为内生真菌，可以快速、特异地诱导药用植物中特定基因的表达，从而激活一系列特定的次生代谢途径，促使有效成分的积累。目前内生真菌诱导子的研究主要有菌体和代谢物两种形式，其中菌体又包括活细胞和菌丝体提取物两个方面。

2.2.1 内生菌菌体作为诱导子 通常通过直接接种内生菌活细胞于宿主植物组培苗和无菌苗等组织培养基中，以研究内生菌活细胞的诱导子效应对宿主植物的诱导作用。Yuan等[76]通过对苍术的生根试管苗接种内生真菌，发现苍术的内生真菌Gilmaniellasp.AL12能够上调与初级代谢（碳固定，碳水化合物代谢和能量代谢）相关的基因和蛋白质表达，并且AL12还上调了参与萜烯骨架生物合成的编码β-farnesene synthase和β-caryophyllene synthase基因的表达，这说明内生菌与植物缔合可以通过增加能量来源，调控糖酵解、三羧酸循环和增强代谢通量来提高生物活性物质含量，同时发现AL12还可以上调苍术中编码L-苹果酸脱氢酶（MDH）和丙酮酸脱氢酶（PDHE）基因的表达，MDH可以促进苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转化提高草酰乙酸的含量，然后经过柠檬酸丙酮酸循环将乙酰辅酶A从线粒体中转运到胞液中，使得丙酮酸和乙酰辅酶A含量升高，表明有更多的前体物质和能量可用于萜类化学成分的生物合成[77]。Li等[37]将石斛内生真菌Mycenasp.MF23接种到石斛组织培养苗中，其可通过调节甲羟戊酸（MVA）途径相关基因的表达来提高石斛中石斛碱的含量。周佳宇[15]研究显示荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）侵染茅苍术后诱导茅苍术体内活性氧（ROS）迸发，同时将不含氧倍半萜氧化成含氧倍半萜。

将宿主植物愈伤组织等置于附有菌丝体提取物诱导子的培养基质中培养已成为提高植物次生代谢物产率的有效策略之一。江曙等[78]从4个产地的明党参植株中共分离到8属116株内生真菌，其中使用内生真菌Fusariumsp.菌丝提取物处理的明党参细胞生长量和多糖含量较非处理组分别提高了31.86%和38.01%。Xu等[36]从丹参中分离得到一株内生真菌易脆毛霉（Mucorfragilis），将丹参毛状根置于添加该菌丝体提取物的液体培养基中培养，发现毛状根中编码乙酰辅酶A硫解酶（AACT）、香叶基二磷酸合成酶（GGPPS）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的基因表达上调，进而使得丹酚酸、迷迭香酸、硬脂酸和油酸等初级和次级代谢物增多。

目前，利用悬浮细胞培养是快速获取药用植物有效成分的途径之一，而内生菌菌丝体提取物可在此基础上进一步提高原有活性物质含量，甚至诱导产生新的代谢产物。有研究发现，在苍术悬浮细胞中只能检测到β-桉叶醇，但是苍术内生小克银杆孢菌（Cunninghamellasp.）AL4的灭活菌丝体作为诱导子可以诱导苍术悬浮细胞产生挥发油，主要包括苍术醇、苍术酮和苍术素，同时β-桉叶醇的含量也显著提高，是同期对照组的2.22倍[79-80]。

2.2.2 内生菌代谢物作为诱导子 药用植物内生菌代谢物能够诱导促进寄主植物中活性物质的生物合成。内生菌和宿主植物的关系可以被视为一种灵活的、动态的相互作用，内生菌可根据寄主植物的生长变化适应性地改变宿主植物的基因表达或代谢物生成，反之亦然。周佳宇[15]研究发现荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）产生的胞外蛋白、胞外多糖及挥发性化合物苯甲醛对苍术挥发油成分的积累具有促进作用，其中苯甲醛可促进苍术醇、β-桉叶醇和苍术酮的积累，胞外多糖可促进β-桉叶醇和苍术酮的积累，胞外蛋白能促进苍术醇的积累。夏伟等[81]使用地黄内生真菌草酸青霉（Penicilliumoxalicum）的灭菌发酵液对地黄组培苗进行诱导处理，与对照组相比，经发酵液诱导的地黄组培苗中梓醇和毛蕊花糖苷的含量分别提高了36%和68.2%。

2.3 内生菌的生物转化作用

微生物繁殖速度快，拥有大量的酶系。药用植物内生菌可利用其产生的胞内或胞外酶对宿主中的化学物质进行生物转化，提高生物活性物质的含量或者通过结构修饰及改造生成新的活性物质[82-83]。

2.3.1 内生真菌的生物转化作用 研究表明，内生真菌可以对宿主植物的活性成分进行羟基化、去糖苷化等修饰。甘草次酸因其水溶性差且长期服用会引起类醛固酮增多症等问题，大大限制了其临床应用，对其进行结构修饰是解决该问题的有效途径。研究发现甘草次酸可被其内生短刺小克银汉霉（CunninghamellablakesleeanaLendner）生物转化成3-酮基-7β，15α-二羟基-18β-甘草次酸、7β-羟基-18β-甘草次酸和15α-二羟基-18β-甘草次酸等5个已知产物和1个新化合物（3-酮基-15β-二羟基-18β-甘草次酸）[84]。该转化过程表现出短刺小克银汉霉对甘草次酸的羟基化作用，在减轻甘草次酸不良反应的同时还改善了甘草次酸的溶解性。武伦鹏等[46]研究发现内生真菌Fungalsp.GH26能够高效地将人参皂苷Rb1转化为药理活性更强的稀有人参皂苷CK，转化率高达76.6%。

2.3.2 内生细菌的生物转化作用 内生细菌对药用植物活性成分进行生物转化多与其糖苷水解酶相关。比如，陈贺等[44]通过巴氏醋酸杆菌（Acetobacterpasteurianus）发酵人参，发现发酵物中人参皂苷Rb1、Rb2、Rd和Rg1的含量显著减少，而稀有人参皂苷CK的含量显著升高，推测该菌株可以将人参中的人参皂苷Rb1等常量皂苷水解成稀有人参皂苷CK。李粟琳等[55]应用保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）等菌种成功水解了三七、人参和西洋参中皂苷类成分的糖苷键，将常量人参皂苷转化为稀有人参皂苷Rh1及CK等。Siddiqi等[85]对人参皂苷乳杆菌（Lactobacillus ginsenosidimutans）EMML 3041T菌株进行了全基因组测序，共鉴定出12组糖苷键水解酶，其中重组酶（GST-BglL.gin-952）显示出良好的将人参皂苷Rg1转化成人参皂苷Rg3（S）的能力。

2.3.3 内生放线菌的生物转化作用 鬼臼毒素是从鬼臼类植物（如桃儿七、山荷叶等）中分离获得的具有抗肿瘤活性的化合物，但其强烈的毒副作用限制了其临床应用。曹松等[86]从桃儿七根茎中分离筛选出一株可将鬼臼毒素转化为4'-去甲基表鬼臼毒素的内生放线菌Streptomycessp.，推测该内生放线菌可能含有O-去甲基化酶和异构化酶。相较于鬼臼毒素，4'-去甲基表鬼臼毒素的毒性减弱、抗肿瘤活性增强，且其抗肿瘤机制也有所不同，因此4'-去甲基表鬼臼毒素更具有开发前景。

3 展望

药用植物内生菌为提升药材质量，获取生物活性成分提供了新途径。首先，可利用内生菌介导的诱导子效应调控植物生长来生产优质药材；其次，利用内生菌可代谢产生与宿主植物相同的活性成分特性直接生产药效物质，提高活性成分的生产效率，解决自然资源不足的现状；第三，也可利用药用植物内生菌的生物转化作用，通过发酵药材来获取药效物质。内生菌也为筛选具有药用价值的活性物质或新型化合物提供了新的源泉。然而，现有研究大部分集中在内生真菌上，在内生细菌和内生放线菌方面仍有很大空白需要填补。同时，内生菌可以产生与寄主药用植物相似或相同的活性成分，有必要明确区分活性成分是由寄主植物产生，还是由内生菌产生，或者是两者联合产生，这将为探索药效物质合成机制提供帮助。总之，药用植物内生菌具有广阔的应用及开发前景，药用植物作为内生菌活动的重要场所，是宝贵的内生菌资源库，其中蕴含的大量具有潜在应用价值的内生菌亟待挖掘。