基于UPLC-Q-TOF-MS/MS联合网络药理学及分子对接研究五味清浊颗粒治疗腹泻药效物质基础和作用机制

李伟，孙佳，李思雨，余秋香，王添敏，宋慧鹏，张慧（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600）

五味清浊颗粒又名当玛-5、通拉嘎-5，为蒙古族验方，始载于《后序医典》，1985年版《中国药典》首次将其载入[1]，由石榴、红花、肉桂、荜茇、豆蔻五味药材组成，具有开郁消食、暖胃的功效[2]。方中石榴为君药，以温胃增火，清肝热为主；红花为臣药，以清热、增强体质为辅；荜茇、肉桂、豆蔻均为佐使药，荜茇温中散寒、止泻化腐；肉桂散寒止痛，益胃火；豆蔻温胃肾[3]。临床上常用于治疗腹泻[4-6]且效果较好，寒证、热证均可使用，但迄今为止，处方药效物质潜在的有效成分及作用机制尚不明确。

网络药理学和分子对接技术是目前预测复方有效成分的有效手段，但目前多以文献报道或TCMSP数据库中收录的化学成分为对象，对五味清浊颗粒进行活性成分的预测，目标性不强，导致预测的活性成分在中药中检测不到，预测的结果没有意义，为此需要在五味清浊颗粒成分确定存在的基础上，进行网络药理学和分子对接的预测。

本论文采用质谱分析技术，对五味清浊颗粒进行分析，以检测到的成分为对象，进行网络药理学和分子对接分析，筛选活性成分，揭示作用机制，为五味清浊颗粒研究奠定基础，指导临床用药。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1290型UPLC仪、Agilent 6550型三重四极杆高分辨质谱仪（配置Dual AJS ESI 离子源）[安捷伦科技（中国）有限公司]、KQ250DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、十万分之一天平（梅特勒 ME55C137550880，精度：0.01 mg）。

1.2 试药

五味清浊颗粒（批号：20211010，规格：3 g/袋，祈蒙股份有限公司），对照品没食子酸（纯度≥98.0%，批号：B20851）、胡椒碱（纯度≥98.0%，批号：B20516）、羟基红花黄色素A（纯度≥98.0%，批号：B20968）、木犀草素（纯度≥98.0%，批号：B20888）、山柰酚（纯度≥98.0%，批号：B21126）、肉桂醛（纯度≥98.0%，批号：B21081）（上海源叶生物科技有限公司）；鞣花酸（纯度≥98.0%，批号：BP0529，成都普瑞法科技开发有限公司）。乙腈、甲酸、甲醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱和质谱条件

2.1.1 色谱条件 采用Eclipsepius C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱：0～13.3 min，7%～22%B；13.3～14.6 min，22%～31%B；14.6～22 min，31%～40%B；22～29 min，40%～60%B；29～35 min，60%～80%B；35～39 min，80%～90%B。检测波长为310 nm；进样体积为3 μL；柱温为30℃；流速为0.4 mL·min－1；分析时间为39 min；柱色谱洗脱液不经分流直接导入质谱系统检测。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），在正、负离子模式下检测，二级质谱采集采用Auto MS/MS模式；干燥气体温度为250℃，干燥气体流速为14 L·min－1；毛细管电压为3500 V，碎裂电压为3500 V，雾化器压力为35 psi，二级质谱碰撞电压为20 eV；质谱采集范围为（m/z）50～2000。

2.2 供试品溶液的制备

取五味清浊颗粒0.75 g置10 mL的量瓶中，加70%甲醇定容，超声（频率40 kHz，功率100 W）30 min，冷却后用70%甲醇补足体积，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.3 对照品溶液的制备

分别称取没食子酸、胡椒碱、羟基红花黄色素A、木犀草素、山柰酚、肉桂醛、鞣花酸适量，加甲醇制成各对照品质量浓度均为50 μg·mL－1的混合对照品溶液，即得。

2.4 结果

2.4.1 化学成分的鉴定 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，按“2.1”项下方法对五味清浊颗粒进行正、负离子全扫描，获得总离子流图，见图1。结合化学对照品，共鉴定和推测出86个化学成分，见表1[7-14]。

图1 五味清浊颗粒的HPLC-Q-TOF-MS/MS负离子模式（A）和正离子模式（B）总离子流图Fig 1 Total ion chromatograms of HPLC-Q-TOF-MS/MS by negative ion mode（A）and positive ion mode（B）for Wuwei Qingzhuo granules

续表1

2.4.2 生物碱类化合物 生物碱类化合物主要来源于荜茇，如胡椒碱、荜茇宁、荜茇酰胺等，质谱裂解规律为胺部分容易失去一个中性哌啶或甲酰基哌啶，末端结构易产生丙烯基亚甲二氧基苯和甲基亚甲二氧基苯[12]。在五味清浊颗粒中鉴别出生物碱类化合物共25个，分别是4、24、58、60、62～65、68～81、84～86。

以65为例，阐述酰胺类生物碱的裂解规律和结构鉴定的解析过程。在正离子模式下，其保留时间为19.416 min，准分子离子峰m/z286.1448[M＋H]＋，根据元素组成综合分析预测可能的分子式为C17H19NO3。母离子在质谱高能碰撞下，丢失C5H11N形成m/z201.0550的碎片离子，再丢失CO形成m/z173.0594的离子碎片，脂肪酸末端产生m/z161.0593[C10H8O2＋H]＋的丙烯基亚甲二氧基苯和m/z135.0441[C8H6O2＋H]＋的甲基亚甲二氧基苯。结合化合物的分子式、裂解规律、碎片信息及与文献对照[12]，确认该化合物为胡椒碱。可能的裂解途径见图2。

图2 胡椒碱的质谱图（A）及裂解规律（B）Fig 2 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of piperine

2.4.3 黄酮类化合物 黄酮类化合物主要来源于红花，如山柰酚、槲皮素、羟基红花黄色素A等。质谱裂解规律为逆狄尔斯-阿德尔（RDA）裂解和丢失中性碎片，在ESI多级质谱中，CO、CO2、C2H2O等中性碎片的丢失首先发生在C环，然后发生在A环上，B环上没有中性碎片的丢失[13]。在五味清浊颗粒中鉴别出黄酮类化合物共23个，分别是15、16、20、22、23、26、28、31、34～36、39～45、47、48、52、53、59。

以53为例，阐述黄酮类化合物的裂解规律和结构鉴定的解析过程。在负离子模式下，保留时间为12.418 min，准分子离子峰m/z285.0405 [MH]－，根据元素组成综合分析预测可能的分子式为C15H10O6，母离子在质谱高能碰撞下丢失CO形成m/z257.0446的离子碎片，再丢失CO形成m/z229.0500的离子碎片。RDA裂解产生m/z153.0181的离子碎片。结合化合物的分子式、裂解规律、碎片信息及与文献对照[13]，确认该化合物为山柰酚。可能的裂解途径见图3。

2.4.4 有机酸类化合物 有机酸类化合物来源于石榴、红花，如绿原酸、没食子酸、苹果酸等。质谱裂解规律为一般丢失CO2和H2O的特征碎片[13]，在五味清浊颗粒中鉴别出有机酸类化合物共12个，分别是1、2、5、8、9、19、32、49、57、67、82、83。

以19为例，阐述有机酸类化合物的裂解规律和结构鉴定的解析过程。在负离子模式下，保留时间为1.889 min，准分子离子峰m/z353.0882[MH]－，根据元素组成综合分析预测可能的分子式为C16H18O9，母离子在质谱高能碰撞下丢失C7H11O5-H2O、C7H11O5-CO2，形成m/z161.0244、m/z135.0453的离子碎片。结合化合物的分子式、裂解规律、碎片信息及与文献对照[13]，确认该化合物为绿原酸。可能的裂解途径见图4。

图4 绿原酸的质谱图（A）及裂解规律（B）Fig 4 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of chlorogenic acid

2.4.5 鞣质类化合物 鞣质类化合物主要来源于石榴，如原花青素B、安石榴林、石榴皮亭B等。质谱裂解规律为通常发生RDA裂解、失去H2O而产生碎片离子峰[9]，在五味清浊颗粒中鉴别出鞣质类化合物共16个，分别是6、7、10～14、18、21、25、27、29、30、33、37、55。

以21为例，阐述缩合鞣质类化合物的裂解规律和结构鉴定的解析过程。在负离子模式下，保留时间为2.662 min，准分子离子峰m/z577.1364[MH]－，根据元素组成综合分析预测可能的分子式为C30H26O12，母离子在质谱高能碰撞下脱去C8H8O3，发生RDA裂解重排得到m/z425.0861离子碎片，接着脱去一个H2O，得到m/z407.0773离子碎片，两个儿茶素断裂，形成m/z289.0719离子碎片，再脱去C9H8O3，经重排裂解得到m/z125.0248离子碎片。结合化合物的分子式、裂解规律、碎片信息及与文献对照[9]，确认该化合物为原花青素B。可能的裂解途径见图5。

2.4.6 苯丙素类化合物 苯丙素类化合物主要来源于肉桂，如桂皮醛、香豆素。质谱裂解规律为内酯环容易丢失CO、CO2产生质量损失28和44的碎片离子[16]。在五味清浊颗粒中鉴别出苯丙素类化合物共2个，分别是38、51。

以38为例，阐述苯丙素类化合物的裂解规律和结构鉴定的解析过程。在正离子模式下，保留时间为6.581 min，准分子离子峰m/z147.0437[M＋H]＋，根据元素组成综合分析预测可能的分子式为C9H6O2，母离子在质谱高能碰撞下失去1分子CO，产生m/z119.0486的离子碎片，再失去1分子CO，得到m/z91.0547的离子碎片。结合化合物的分子式、裂解规律、碎片信息及与文献对照[16]，确认该化合物为香豆素。可能的裂解途径见图6。

图6 香豆素的质谱图（A）及裂解规律（B）Fig 6 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of coumarin

2.5 治疗腹泻的网络药理学分析

2.5.1 活性成分和疾病的靶点筛选 将UPLC-QTOF-MS/MS鉴别获得的86个化学成分代入TCMSP中，根据药代动力学特征（ADME）筛选得到活性成分。利用TCMSP 和 Swiss Target Prediction得到候选靶点1014个。以“Diarrhea”为关键词，在GeneCards、OMIM等数据库筛选得到腹泻相关靶点320个。最终筛选出五味清浊颗粒治疗腹泻疾病潜在靶点57个。利用Cytoscape 3.7.1软件构建“活性成分-作用靶点”网络，将活性成分按度值（Degree）排序，筛选排名靠前的6个成分，分别为槲皮素、木犀草素、鞣花酸、胡椒碱、山柰酚、荜茇宁。

2.5.2 蛋白质互作网络（PPI）构建与分析 将“活性成分-疾病”交集靶点导入String数据库，绘制PPI。利用Cytoscape 3.7.1软件进行可视化，见图7。利用Network Analyzer工具进行拓扑分析，以Degree为基准排序，最终筛选排名靠前的6个靶点，分别为IL-6、TNF、EGFR、IFNG、IL-10、IL-8。

图7 五味清浊颗粒治疗腹泻疾病PPI网络Fig 7 PPI network of Wuwei Qingzhuo granules in treating diarrhea

2.5.3 GO功能及KEGG通路富集分析 应用Metascape数据库，对GO功能排名前10的条目及KEGG排名前20的通路进行可视化。GO分析得到生物过程（BP）条目3251个，细胞组分（CC）条目287个，分子功能（MF）条目478个。KEGG通路富集分析得到107条通路，富集的主要信号通路包括PI3K-Akt、JAK-STAT、HIF-1等信号通路，见图8。

图8 五味清浊颗粒治疗腹泻疾病靶点基因的GO及KEGG富集分析Fig 8 GO and KEGG enrichment analysis of target genes of Wuwei Qingzhuo granules in treating diarrhea

2.5.4 “核心成分-作用靶点-通路”网络构建与分析 利用Cytoscape 3.7.1 软件构建五味清浊颗粒核心成分-作用靶点-通路相互作用网络图，见图9。由图9可知，五味清浊颗粒活性成分通过作用于多个靶点、多条通路发挥作用，且成分、靶点、通路间存在错综复杂的关系。

图9 五味清浊颗粒治疗腹泻疾病 “核心成分-作用靶点-通路”图Fig 9 “Core ingredient-target-pathway” diagram of Wuwei Qingzhuo granules in treating diarrhea

2.5.5 分子对接验证 利用AutoDock Vina进行分子对接验证，见表2。对接结合能均小于－20 kJ·mol－1，表明核心成分与核心靶点结合稳定，部分对接构象见图10。

表2 五味清浊颗粒核心成分和核心靶点的结合能Tab 2 Binding energy of core components and core targets of Wuwei Qingzhuo granules

4 讨论

腹泻是一种临床常见的消化道疾病，主要表现为排便次数增加和大便流动性增加[17]。腹泻会导致机体丢失大量体液，引起脱水和电解质平衡紊乱，引起腹泻的病因较多，发病机制较复杂，可能是由于肠道吸收减少、渗透性活性电解质分泌增加、胃肠道快速转运引起的[18-19]。五味清浊颗粒是蒙医临床治疗腹泻的经验方，本文以其作为研究对象，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术联合网络药理学及分子对接探讨治疗腹泻的药效物质基础和作用机制。

通过网络药理学筛选出6个核心成分，分别为槲皮素、木犀草素、鞣花酸、胡椒碱、山柰酚、荜茇宁。相关药理研究表明，槲皮素、山柰酚可抑制肠道运动，降低腹腔毛细血管的通透性、抑制肠内水分和电解质的分泌以及修复上皮黏膜治疗腹泻[20-21]，鞣花酸对肠道上皮细胞具有显著的保护作用，能够促进肠道内容物中营养物质的吸收，防止肠道中的致病菌在肠道上皮细胞中定植[22]。木犀草素具有抗炎作用，在调节肠道免疫系统和治疗慢性炎症性肠病中发挥重要作用，可以减少小肠内容物的体积和重量，从而发挥止泻作用[23]。胡椒碱、荜茇宁具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抑菌等多重药理功效，在止泻和调节肠道免疫系统起着重要作用[22-23]。

五味清浊颗粒治疗腹泻共51个相关靶点，根据PPI网络预测结果最终筛选出6个核心靶点，主要包括IL-6、TNF、EGFR、IFNG、IL-10、IL-8等，体现中药治疗疾病的多靶点特点。其中IL-6作为关键促炎因子[24]，通过刺激趋化因子的产生并激活肠道黏膜局部免疫反应，导致肠道动力改变以及肠道敏感度增高，炎症细胞也随之增多，激活肠道免疫系统，导致肠道通透性的增高，进而引起腹痛、腹泻[19]。动物实验表明，TNF-α抗体或基因的缺失可有效减轻炎症性肠病[25]。EGFR通过与其受体结合激活多个信号通路来刺激上皮细胞的生长、增殖和分化，在调节肠黏膜屏障功能方面发挥重要作用[21]。IFNG在免疫反应中起重要的调节作用，T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞以及单核巨噬细胞能产生大量的IFNG，其能诱导NF-κB等炎症因子释放[26]。KEGG通路富集分析结果显示，51个交集靶点显著富集于PI3KAkt、JAK-STAT、HIF-1信号通路等关键信号通路。JAK-STAT信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡，可通过调控其来抑制炎性细胞因子的产生，减轻肠黏膜损伤。HIF-1为肠道炎症的关键调节因子，腹泻会导致肠道菌群失调并会造成机体局部缺氧，使得HIF-1信号通路激活[19]，可通过抑制其激活，减轻肠道炎症反应。PI3K-Akt信号通路与腹泻的发生最为密切，可通过抑制其活化，促进细胞自噬与细胞凋亡，降低促炎症因子 IL-6释放，减轻肠道炎症反应，达到保护肠道黏膜的作用[22，27]。分子对接结果显示，核心成分与核心靶点间均具有良好的结合性能。

综上，本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术联合网络药理学和分子对接技术充分表明五味清浊颗粒可通过多成分、多靶点、多途径协同发挥治疗腹泻作用，可为后期五味清浊颗粒的药效物质基础研究提供参考依据。