连翘种子品质检验及质量分级标准研究

邹晨鑫，彭毅丹，刘亦欣，谭启怡，颜永刚，孙静，杨新杰（陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046）

连翘Forsythiasuspensa（Thunb.）Vahl.为木犀科连翘属落叶灌木，早春先花植物，具观赏价值，为重要的园林绿化植物[1]。在中医临床中以其干燥果实作为药用，通常在果实刚成熟还带有绿色时进行采收，通过蒸熟或者沸水煮片刻后晒干，将其称为“青翘”，在果实成熟后采收晒干，称之为“老翘”。连翘始载于《神农本草经》[2]，其性味苦、微寒，归肺、心、小肠经，具有清热解毒、散结消肿、疏散风热等功效，主治痈疬，风热感冒，温病初起，高热烦渴，神昏发斑，热淋涩痛等病症[3]，用途较广。连翘果实中含黄酮类、苯乙烷类、挥发油类等成分[4]。现代研究表明，连翘具有抗炎[5]、抗病毒[6]、抗菌[7]、抗氧化、解热[8]、抗内毒素、抗肿瘤[9-10]、调节免疫[10]等作用。

连翘的药材商品主要来源于野生资源，被列为国家计划管理品种[11]。近年来随着连翘的观赏和药用价值的不断被开发利用，野生资源的保有量难以满足市场需求，寻求人工播种育苗为最简单有效的途径之一[12]。科学的种植栽培是确保药材品质的一个重要措施，优质的种子是进行连翘种植栽培的重要保证，这也是对连翘种子做质量标准评价的重要原因。制订出连翘种子的质量标准，可以为连翘种子的筛选和使用提供参考价值。

有文献对连翘种子品质进行过相关的研究，但所收集的连翘种子范围较小，制订的标准较低[13-14]。此次研究过程中扩大了连翘种子的范围，采集16份来自全国连翘主产区的连翘种子，评价连翘种子品质，进行种子的质量分级研究，以期为连翘种子品质标准的制订提供参考依据。

本研究主要对种子形态色泽、千粒重、含水量、生活力、发芽率和发芽势进行测定。在实验过程中使用到的方法有四分法测量净度、徒手减半法测量千粒重、TTC法测定种子生活力、高温烘干法测定含水量以及水培法测定种子发芽率。以上实验方法在种子质量标准制订中较为经典，被广泛用于种子相关实验，具有科学性。在进行数据处理时运用K-均值聚类法和统计学分析来对数据进行处理，K-均值聚类法的优点在于对大型数据集也是简单高效，时间复杂度、空间复杂度低。最终参考综合影响因素和实际情况在所得数据的基础上进行连翘种子的质量分级标准的制订。

1 材料与方法

1.1 仪器

FA2104万分之一电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；MGC-300H人工气候培养箱、DHG-9030电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试药

2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC，含量≥98%，福州飞净生物科技有限公司）。于2020年9月下旬选择陕西、山西、河北、河南、山东等五省种植基地对连翘种子进行收集，用于质量检验方法评价和质量标准研究。种子编号和具体产地见表1。所有的种子都通过陕西中医药大学中药标本馆王继涛高级实验师鉴定，均为木犀科植物连翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl.的种子。

表1 连翘种子来源Tab 1 Source of Forsythia suspensa seeds

1.3 方法

1.3.1 净度分析 参照GB/T3543.2农作物种子检验规程扦取样品，采用四分法[15]。取种子近5 g，置于桌面上分离净种子。使用电子天平进行精密称重，并且计算净种子含量的百分比，所有样品重复称量3次，最终取其平均值。净度公式如式（1）所示。

1.3.2 千粒重的测定 将净种子混合均匀，采用徒手减半法[16-17]从样本中取250粒取4份，共1000粒为1组，用分析天平称重，重复3次，取平均值。

1.3.3 含水量的测定 采用高温烘干法[18]，称取0.5 g种子放入干燥培养皿中，放置在温度达（131±2）℃的恒温烘箱内烘1 h后取出放入干燥器内冷却后称重。计算种子含水量，公式如式（2）所示。

式中M1为培养皿质量，M2为培养皿及样品烘干前质量，M3为培养皿及样品烘干后质量。

1.3.4 生活力的测定 采用TTC法测定[19]连翘种子的生活力，活的种子具有一定的呼吸作用，而呼吸作用产生的脱氢酶可使无色的氧化态TTC还原成红色物质，该方法简便易行，准确率高，是测定种子生活力的常用方法。使用0.5%的TTC溶液对连翘种子进行染色，拿刀片将种子纵切成两瓣取其中一瓣于常温染色12 h后倒出TTC溶液并使用清水冲洗种子，观察种子染色情况，若种子大部分或者全部被染红说明种子有生活力。

1.3.5 发芽率测定 从收集的连翘果实中收取种子，置于干燥处贮藏。把样品种子置于培养皿中并加自来水浸泡2 h，取沉于水中的饱满种子，使用1%高锰酸钾溶液消毒30 min，最后使用自来水、蒸馏水依次冲洗备用。将培养皿、镊子以及滤纸放入高压灭菌锅中灭菌，在培养皿的底部放2层划有网格线的湿滤纸作为发芽基质，将处理好的连翘种子放入培养基中，用滴管定期补清水，使种子保持湿润状态，连翘种子以胚根露白为发芽标准[18]。

每个培养皿（d＝90 mm）放入50粒种子，每组实验重复3次，均在人工气候培养箱内进行培养，培养箱中温度为25℃，湿度为60%，光照强度均为12 000 lx[14]。记录种子发芽情况，观察14 d后，统计种子的总发芽数，计算发芽率和发芽势，公式如式（3）所示。发芽势是发芽期间日发芽数达到最大值，发芽的种子数占供试种子数的百分率。

1.3.6 种子基本特征鉴定 将健康饱满的种子置于桌面上，使用游标卡尺测量30粒种子的长和宽，并观察种子颜色、形态及表面特征。

2 结果与分析

2.1 种子净度

从表2、3可以看出不同地区的连翘种子净度差异较大，分布在31.86%～94.60%，平均值为60.47%。由此可知，不同地区连翘种子的净度差别较大，含果皮、果梗、短枝、石子等杂质，其中河北省保定市安国市河西村（Z10）的连翘种子净度最高，陕西省商洛市洛南县灵口镇（Z3）的连翘种子净度最低。主要原因是不同产地对连翘种子采集加工处理的方式不同，有些产地种子加工处理较为粗糙，导致种子净度过低。

表2 连翘种子质量检测结果分析Tab 2 Quality analysis of Forsythia suspensa seeds

表3 16批连翘种子质量检测结果Tab 3 Quality of 16 batches of Forsythia suspensa seeds

2.2 千粒重

来自全国主产区的16份连翘种子的千粒重在2.12～3.81 g，平均值为2.88 g。其中千粒重最小的是来自陕西延安市黄龙县（Z14）的种子，河南洛宁县（Z13）的种子的千粒重最大（见表2、3）。

2.3 含水量

来自全国主产区的16份连翘种子的含水量在2.72%～8.45%，平均含水量为4.82%。其中含水量最低为2.72%，来自河南省洛阳市嵩县（Z12），河北省邯郸市涉县（Z11）的含水量最高为8.45%（见表2、3）。

2.4 种子活力

来自全国主产区的连翘种子之间的生活力有很大的区别，本次实验16份连翘种子的生活力在23.33%～90.67%，平均生活力为55.54%。其中生活力最低的为陕西省宝鸡市眉县营头镇（Z15）的种子，最高的为河北省保定市安国市河西村（Z10）的种子。生活力测定结果区别较大的原因主要与实验所选用的染色方法、染色时间、染色温度以及染色试剂的浓度等有关[16]，故本次实验测定各产地连翘种子生活力时，统一测定标准，减少误差（见表2、3）。

2.5 发芽率与发芽势

来自全国主产区的16份连翘种子发芽率和发芽势之间有着很大的区别，发芽率变化范围为0～92.00%，发芽势的变化范围是0～36.00%。其中最高的为河北省保定市安国市河西村（Z10）的种子发芽率高达92.00%；陕西省商洛市洛南县石门镇、陕西省商洛市山阳县色河铺镇、陕西省商洛市商南县湘河镇、河南省洛阳市嵩县白云山、河南省洛宁县神灵寨和陕西省宝鸡市眉县营头镇的种子发芽率均未达10.00%，其中陕西宝鸡市眉县营头镇（Z15）的种子发芽率为0，为16份样本中最低。河北省保定市安国市河西村（Z10）的种子发芽势最高达36.00%，陕西省宝鸡市眉县营头镇（Z15）的种子发芽势最低为0。通过对产地分析的比较可以发现，各个连翘产地的生态环境和气候环境都有所差异，会导致连翘种子的成分和水分的含量不同，经研究发现河北省的连翘种子的发芽率普遍高于其他省份。

2.6 种子基本特征鉴定

连翘种子扁平，椭圆形，一侧具薄翅，且翅不规则，使连翘一端呈三角形，一端呈半圆形；成熟种子黄棕色或黑褐色，饱满，气微香，质坚脆；种子长5.14～6.36 mm，宽1.56～2.34 mm。

2.7 种子质量分级标准的制订

2.7.1 K-均值聚类分析 通过SPSS 20.0软件以及Excel统计数据分析对连翘种子的五项数据进行K-均值聚类分析并分为三级，最终类中心值见表4。16份连翘种子中1级有1个（Z10），2级有9个（Z2、Z5、Z7、Z12、Z13、Z14、Z15），3级有5个（Z1、Z3、Z4、Z6、Z8、Z9、Z11），具体见图1和表4。

图1 连翘种子聚类分析树状关系图Fig 1 Forsythia suspensa seeds cluster analysis

表4 K-均值聚类最终类中心(n＝16)Tab 4 K-mean cluster final class center (n＝16)

2.7.2 种子质量分级标准的制订 通过K-均值聚类分析，初步将所测得的种子分为三类，根据分析数据最后确定在连翘种子的分级标准过程中，把发芽率和生活力作为一级参数，因为种子是否具有活性和发芽率直接关系到连翘的产量，将种子的净度、含水量以及千粒重作为二级参数。研究其他影响因素和K-均值聚类分析，并参考实际情况，制订出连翘种子质量分级标准（见表5），在分级标准中一级可作为品质良好的种子，可在生产过程中优先考虑。二级为质量合格的种子，可在栽种生产中可选择性使用。三级为未达标的种子，不建议在种植栽培过程中使用此类种植，否则收益不佳。

表5 连翘种子质量分级标准Tab 5 Quality classification standards of Forsythia suspensa seeds

3 结论

3.1 不同产地连翘种子品质检验结果

不同产地的连翘种子各项指标之间有较大的差异，种子形态长5.14～6.36 mm，宽1.56～2.34 mm。发芽率在0～92.00%，生活力在23.33%～90.67%；平均生活力为55.54%。净度在31.86%～94.60%，平均值为60.47%；千粒重在2.12～3.81 g，平均值为2.88 g。含水量在2.72%～8.45%，平均含水量为4.82%。河北省保定市安国市河西村连翘种子的净度、生活力、发芽率及发芽势较高，陕西宝鸡市眉县营头镇连翘种子的各项指标值相对较低，其连翘种子的发芽率为0，可能与其种子为陈旧种子或存储不当有关。

3.2 连翘种子质量初步分级标准

通过K-均值聚类分析，可将不同产地连翘种子初步分为三类，其中一级为品质良好的种子，二级为质量合格的种子，三级为未达标的种子。通过分析可知，影响连翘种子质量的主要因素有发芽率、发芽势、生活力、种子净度、千粒重、含水量。根据国际种子的分级标准，结合连翘生产的现状，综合考虑选定发芽率、生活力、千粒重、水分、净度作为连翘种子质量分级标准，初步制订了连翘种子等级规定值。

4 讨论

通过试验结果可以发现来自不同产地的连翘种子的质量存在较大差异。净度差异较大是因为种子中含果皮、果梗、短枝、石子等杂质，不同产地的连翘种子因采收时间及加工方法不同导致所含杂质有差异。千粒重和含水量的差异可能是由于不同产地间的气候及生态环境不同，导致种子的颗粒大小以及饱满度有较大差异。其中作为种子质量最重要参数发芽率和生活力在不同产区之间也有很大的差异，这对本次试验的最终目的即制订连翘种子质量标准起到主要影响。本次试验连翘种子的发芽率在0～92.00%；生活力在23.33%～90.67%。分析其发芽率与生活力的差异大与地理分布、气候环境、采收时节以及贮藏过程都有着很大的关系。

在中医药临床应用中连翘以果实入药，具有清热解毒、消肿散结等功效；其药材商品主要来源于野生资源。但是近年来随着对连翘的不断研究开发，连翘的野生资源保有量难以满足市场需求，所以人工栽培种植变为连翘药材的主要来源之一。目前市场上并没有连翘种子统一的质量标准，市售连翘种子中常常出现以次充好、新老种子混合出售等情况，从而导致连翘种子质量混乱，严重影响连翘药材的种植。因此对连翘种子进行品质检验和质量标准分级研究尤为必要，是连翘药材规范化生产亟待解决的重要问题。

本实验严格按照《农作物种子检验规程》及有关种子分级方法要求，结合连翘种子的自身特点进行连翘种子质量的初步研究，所提出的分级标准可供有关部门制订通用标准时参考。