基于网络药理学和动物实验探讨桃红四物汤抗缺血性脑卒中的分子机制

王艺霖，孟祥国，叶宇航，胡霞敏*（1.上海中医药大学研究生院，上海 010；.上海健康医学院，上海 0118；.上海理工大学，上海 0009）

缺血性脑卒中，中医称之为中风，是指由于脑的供血动脉（颈动脉和椎动脉）狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死的总称[1]，具有高发病率、高死亡率和高致残率等特点[2]。目前临床上被FDA认证的治疗方法只有静脉溶栓及动脉取栓[3]，其目的是迅速恢复缺血区的血流，挽救缺血半暗带的神经元，缓解脑组织因缺血缺氧引起的神经功能损伤[4]，但由于治疗时间窗狭窄限制了其在临床上的应用。

《内经》有对中风病病机进行论述：情志失调，血逆瘀于脑，是中风病发生的根本机制[5]。桃红四物汤（Taohong Siwu decoction，THSWD）是《医宗金鉴》记载的经典名方，由桃仁、红花、当归、川芎、白芍、熟地黄六味药材组成[6]。其在四物汤补血养血的基础上，加入活血祛瘀的桃仁及活血通经的红花，使此方养血而不滞血，活血而不破血，补中有行，破中有收，六药合用，达到活血行气、扶正祛邪之功效[7]。临床表明，桃红四物汤对缺血性脑卒中有明显的治疗作用[8]，但其机制有待进一步阐明。本研究通过网络药理学及实验验证探讨桃红四物汤治疗脑卒中的物质基础及可能的分子机制，为后续实验研究提供研究思路。

1 材料

1.1 实验动物

C57BL/6 小鼠50 只（雄性，SPF级，浙江维通利华实验动物技术有限公司，6～8周，No：20220923Abzz0619000896），饲养于上海健康医学院实验动物中心，进食进水自由，动物实验通过上海健康医学院实验动物伦理委员会批准（伦理批件号：20220621）。

1.2 试药

2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，上海阿达玛斯试剂有限公司，货号：45959B），兔抗PI3K（货号：4228S）、AKT（货号：4060S）、白细胞介素（IL）-1β（货号：12242S）、IL-18（货号：57058S）（Cell Signaling Technology公司），β-actin（美国 Proteintech Group 公司，货号：81115-1-RR），HRP 标记的山羊抗兔 IgG HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：GB23301）。

桃红四物汤组方：川芎8 g（批号：230513），桃仁9 g（批号：2023062101），当归12 g（批号：230902），熟地黄15 g（20230707），红花9 g（批号：20230717-1），白芍10 g（批号：230717）（上海中医药大学附属曙光医院）。根据小鼠与人体表面积比值系数减压浓缩至0.36 g·mL－1。

1.3 仪器

体视显微镜（日本Olympus公司），EPS-600 数显式稳压稳流电泳仪、Tanon 4800 系列全自动化学发光/荧光图像分析系统（上海天能科技有限公司），多普勒激光散斑血流仪（上海瑞沃德有限公司）。

2 方法与结果

2.1 网络药理学

2.1.1 桃红四物汤核心成分-核心靶点-通路网络的构建 应用TCMSP和Uniprot数据库，以口服生物利用度≥30%，分子类药性≥0.18为标准筛选获取桃红四物汤活性成分及活性成分的预测靶点，再通过GeneCards、PharmGkb、OMIM、TTD、Drugbank 5个疾病数据库获取缺血性脑卒中相关的疾病靶点，两者取交集，将活性成分和交集靶点导入Cytoscape 3.9.0构建“活性成分-作用靶点”网络获得9个核心化合物：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）、黄芩素（baicalein）、杨梅酮（myricanone）、β-胡萝卜素（beta-carotene）、常春藤皂苷（hederagenin）。交集靶点上传至STRING数据库，筛选score＞0.95的靶点导入Cytoscape构建PPI网络，获得12个潜在核心靶点，分别为MAPK14、RELA、TNF、TR53、MAPK1、MYC、FOS、HSP9AA1、ESR1、AKT1、HF1A、CTNNB1。利用使用R语言软件的R包“ClusterProfiler”对交集靶点进行通路富集分析，选取前8条通路，运用Cytoscape软件构建“核心成分-核心靶点-通路”网络图，见图1。PI3K/AKT信号通路是调节细胞迁移、增殖、分化和凋亡的重要途径，为经典的抗凋亡/促生殖的信号传导通路之一，是预防缺血性脑卒中的关键级联信号通路，其通过调节线粒体障碍、细胞凋亡、细胞自噬、氧化应激和炎症反应等多种机制在抗脑卒中中发挥重要作用[9]。由图1可发现核心靶点AKT1、RELA、TP53、MYC、HSP、MAPK1涉及PI3K/AKT信号通路。

图1 “核心成分-核心靶点-通路”网络图Fig 1 Core compound-core target-pathway network

2.1.2 GO功能富集分析 通过R包“ClusterProfiler”对交集靶点GO功能富集分析获得2823个GO功能条目，主要涉及氧化应激、炎症反应等生物过程（BP）。交集靶点在BP、细胞组分（CC）、分子功能（MF）中显著富集的前10个GO条目，见图2。研究发现，神经炎症在缺血性脑卒中中发挥重要作用[10]。脑缺血后继发性损伤的机制可能是由于缺血性脑卒中后脑内炎症的产生，炎症反应加快了缺血性损伤的形成并影响神经元死亡和神经组织再生。提示桃红四物汤发挥脑保护作用可能与抗炎有关。

图2 桃红四物汤与缺血性脑卒中疾病GO富集分析图Fig 2 GO functional enrichment analysis of THSWD in treating ischemic stroke

2.1.3 分子对接 将鉴定筛选得到的9个潜在核心化合物作为配体，将涉及PI3K/AKT信号通路的核心靶点蛋白和PI3K蛋白作为受体进行分子对接。首先，从TCMSP数据库下载核心成分的结构并以mol2格式保存。然后从RCSB（PDB）数据库下载核心靶点的配体结构，使用Autodock对接每个成分和配体。结合能＜－5 kcal·mol－1的对接分数表明该化合物与靶点之间具有良好的结合活性，结合能越低，说明结合活性越好。结果表明，大部分核心成分与PI3K/AKT相关蛋白具有较好的结合能力，进一步验证了桃红四物汤可能通过调节PI3K/AKT信号通路防治缺血性脑卒中，见表1。将结合能较低的对接结果进行可视化，见图3。

表1 分子对接结合能Tab 1 Binding energy of molecular docking

图3 分子对接结果可视化Fig 3 Visualization of molecular docking results

图4 激光多普勒血流图Fig 4 Laser Doppler flow chart

2.2 动物实验验证

2.2.1 动物分组及给药 将小鼠适应性喂养7 d后，随机分为假手术组（Sham组），模型组[脑缺血再灌注损伤（MCAO/R）组]，桃红四物汤低、中、高剂量组，每组10只。于饲养第8日开始给药，假手术组、模型组给予蒸馏水，10 mL·kg－1灌胃；桃红四物汤低、中、高剂量组分别给予桃红四物汤煎煮液0.9、1.8、3.6 g·kg－1灌胃。

2.2.2 MCAO/R模型小鼠的构建 小鼠饲养第11日，除空白组外，其余各组均依据Zea-Longa线栓法[11]的操作步骤建立MCAO/R小鼠模型，采用激光多普勒血流仪分别于缺血前、缺血后5 min和再灌注后5 min监测小鼠脑血流情况，与缺血前相比，缺血后的小鼠左脑血流明显缺失，再灌注后大部分血流恢复，表示小鼠造模成功。空白组10 只，模型组8只，桃红四物汤低、中、高剂量组各9 只造模成功，分别于术后24、48、72 h分别进行神经功能学评分，评分后采用二氧化碳气体麻醉处死，每组3只小鼠断头取脑，－20℃冰箱中保存，待TTC染色；每组3只小鼠同法取右侧大脑组织置液氮中速冻固定，－80℃冰箱中保存，供Western blot检测用。

2.2.3 桃红四物汤对MCAO/R小鼠神经功能损伤的影响 参照Zea-Longa评分标准和mNss法分别于缺血1.5 h再灌注24、48 和72 h对神经功能缺损评分。Longa法评分标准：0分，无神经功能缺损；1 分，对侧前爪不能完全伸展；2 分，向对侧自发性旋转；3分，向对侧倾倒；4 分，意识丧失。mNSS法评分项目包括运动实验、感觉实验、平衡木实验、反射丧失和不正常运动4项，评分从0～18 分，0 分为正常无缺陷，18 分为最大缺陷。结果显示：与 Sham组相比，模型组神经功能评分明显增高，主要表现为提尾时右侧前爪不能完全伸直，置于水平桌面时，向患侧转圈，偏瘫等症状；与模型组相比，桃红四物汤中、高剂量组能明显减轻神经功能障碍，见图5。

图5 桃红四物汤对C57BL/6小鼠MCAO/R Longa评分和mNss评分的影响Fig 5 Effect of THSWD on Longa score and mNss score of MCAO/R mice

2.2.4 桃红四物汤对MCAO/R小鼠脑梗死体积的影响 TTC是一种脂溶性光敏感复合物，常用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗死，可使正常脑组织染成红色，缺血区因组织坏死呈白色。取－20℃冰箱中脑组织迅速自视交叉点前后1 mm厚度冠状面切片（约5片），置于1%TTC溶液中，37℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛溶液4℃固定过夜，扫描拍照。用Image J软件计算脑梗死体积。脑梗死体积（%）＝左侧脑半球梗死范围/（左侧脑半球总范围＋右侧脑半球总范围）×100%。结果显示，与Sham组相比，模型组脑梗死体积明显升高；与模型组相比，桃红四物汤中、高剂量组脑梗死体积明显减小，且高剂量组脑梗死体积减小最明显，表明桃红四物汤可有效减少小鼠MCAO/R后脑梗死体积，见图6。

图6 桃红四物汤对小鼠脑梗死体积的影响Fig 6 Effect of THSWD on the infarct volume

2.2.5 桃红四物汤对MCAO/R小鼠脑组织PI3K、AKT蛋白表达的影响 网络药理学及分子对接技术提示桃红四物汤可能通过激活PI3K/AKT信号通路调节神经炎症发挥脑保护作用。用Western blot方法对脑组织中PI3K、AKT蛋白表达进行检测。取Sham组、MCAO/R组及药效最为明显的桃红四物汤高剂量组左半脑组织，加入RIPA裂解液匀浆，提取蛋白。蛋白样本经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭后加入PI3K、AKT、β-actin抗体，4℃孵育过夜；加入对应山羊抗兔/鼠抗体，孵育2 h，使用ECL发光系统显像，使用Image J软件进行灰度值（DPI）分析。结果显示，与Sham组比较，模型组小鼠脑组织PI3K、AKT蛋白表达均降低；与模型组比较，桃红四物汤组小鼠脑组织PI3K、AKT蛋白表达升高（见图7）。

2.2.6 桃红四物汤对MCAO/R小鼠神经炎症的影响

基于以上分析结果，检测了脑组织中IL-1β、IL-18炎性因子的蛋白表达。结果显示（见图8），桃红四物汤可明显降低小鼠促炎因子IL-1β、IL-18的水平。

图8 桃红四物汤对IL-1β、IL-18蛋白表达的影响Fig 8 Effect of THSWD on the expression of IL-1β and IL-18 protein

2.2.7 统计学分析 本实验采用 GraphPad Prism 9 软件对数据进行统计学分析。采用单因素方差，后用Turkey法分析两组间差异分析进行统计学分析，用均数（mean）±标准误（SEM）表示，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 讨论

中医认为中风是由于气血逆乱，脑脉痹阻或血溢于脑所致。因此，活血理气是其基本治疗原则。桃红四物汤方中桃红、红花为主，主力活血化瘀；熟地、当归养血；白芍补血；川芎活血行气，是活血化瘀的经典名方。本研究使用网络药理学及分子对接技术初步探讨了桃红四物汤抗缺血性脑卒中的机制，利用TCMSP数据库共获取到桃红四物汤的成分43个，治疗缺血性脑卒中的靶点179个，进一步筛选获得桃红四物汤干预缺血性脑卒中的主要成分可能为槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、黄芩素、杨梅酮、β-胡萝卜素、常春藤皂苷，核心靶点可能为AKT1、

RELA、TP53、MYC、HSP、MAPK1、TNF、MAPK14等。槲皮素[12]、木犀草素[13]、β-谷甾醇[14]、山柰酚[15]、黄芩素[16]、豆甾醇[17]、常春藤皂苷[18]有相关抗脑卒作用的文献报道，AKT1、TNF、MAPK1、MAPK14等核心靶点与炎症反应的调节密切相关，这与现代药理学研究发现桃红四物汤具有抗炎的药理作用一致。

GO分析和KEGG分析富集结果显示桃红四物汤抗缺血性脑卒中的潜在靶点涉及对脂多糖的反应、氧化应激等多种生物学过程，涉及脂质和动脉粥样硬化通路，PI3K/AKT信号通路等。本研究从以上分析中选取了PI3K/AKT信号通路相关蛋白，并利用分子对接技术将核心成分与PI3K/AKT信号通路相关蛋白进行分子对接，发现核心成分与PI3K/AKT信号通路相关蛋白具有较好的结合能力。由于炎症反应和PI3K/AKT信号通路在缺血性脑卒中的发生发展中起重要作用，所以我们可以推断桃红四物汤抗缺血性脑卒中的机制可能与激活 PI3K/AKT多条信号通路和调节神经炎症有关。

在小鼠MCAO/R模型上对桃红四物汤抗脑缺血再灌注损伤的保护作用进行验证，结果发现，桃红四物汤可明显降低MCAO/R模型小鼠的神经功能评分，改善神经功能障碍；TTC染色显示桃红四物汤可显著缩小脑梗死体积，表明其对缺血性脑卒中有较为显著的防治作用。同时，根据网络药理学及分子对接结果的提示，我们对PI3K/AKT信号通路相关蛋白和炎症因子IL-1β、IL-18表达水平进行了检测。结果显示桃红四物汤可明显提高PI3K、AKT的蛋白表达，降低IL-1β、IL-18的表达。以上结果表明桃红四物汤能激活PI3K/AKT信号通路，减轻神经炎症，发挥抗脑缺血再灌注作用。

综上，本研究探讨中医传统药方桃红四物汤抗脑卒中可能的作用机制。结合现代中药网络药理学及分子对接技术对桃红四物汤抗脑卒中的关键成分及作用靶点进行了推测，并选择了其中较为重要的PI3K/AKT信号通路进行了初步的验证，提示桃红四物汤作用机制与激活PI3K/AKT信号通路，减轻神经炎症有关，该研究结果对丰富桃红四物汤的现代研究，进一步探索桃红四物汤防治缺血性脑卒中的作用机制提供了线索，对其二次开发具有重要意义。但本研究仅对网络药理学推测结果中的PI3K/AKT通路进行了验证，因此要阐明桃红四物汤抗脑卒中的作用机制仍需更深入的研究。