基于HS-SPME-GC-MS 和化学计量学对不同产地红枣香气成分的分析

胡航伟，张仁堂，张楠楠，梁 辰，游新侠，孔欣欣，朱 玲，闫信想，刘云国,

（1.郑州科技学院食品科学与工程学院，河南郑州 450064；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271018；3.临沂大学生命科学学院，山东临沂 276000）

枣（Ziziphus jujubaMill.），鼠李科枣属，是我国重要经济果树，栽培历史悠久，在全球范围内分布于热带、亚热带和暖温带地区[1-4]。我国枣的产区主要集中于北方，包括河南、河北、山东、陕西、山西、新疆、宁夏等地。其中，新疆枣树种植面积约44.5 万公顷，已成为我国最大的枣果产区[5-6]。枣果因其含有丰富的营养物质，包括糖类、脂肪酸、氨基酸、矿物质、维生素、类黄酮及其糖苷类等，在日常消费中需求量很大，被视为是一种功能性食品[7-8]。据报道，枣中的多糖物质具有保肝活性和免疫调节作用；此外，枣果实还具有一定的抗氧化能力[9-10]，食用方便，深受消费者的喜爱。但由于种植区域、气候条件、土壤环境等影响，导致枣果的品质出现明显的不同。

香气是评价红枣品质的重要指标之一。目前，已经在红枣中发现了50 多种芳香化合物。其中，乙酸、己酸、辛酸、己醛、（E）-2-己烯醛、（Z）-2-庚烯醛和苯甲醛是红枣中常见的香气化合物[11-13]。当前，关于红枣品质评价的研究，多围绕着干制方式、包装材料、烘烤温度、加工过程变化等方面。Wojdyło等[14]研究对流干燥、真空微波干燥、对流-真空微波干燥、冷冻干燥4 种方式对不同品种枣果品质的影响。结果发现，冷冻干燥、真空微波干燥处理后枣果的生物活性物质含量和感官评价得分更高。Fu 等[15]分析不同干制成熟期枣果组成成分的变化。其中，不同时期枣果的糖分、脂肪酸、有机酸和氨基酸含量差异显著。主成分分析的结果也能对不同成熟期枣果进行很好地区分。解云等[16]采用电子鼻和电子舌技术测定红枣中香气和滋味成分。结果发现，电子鼻技术能够对样品风味物质进行很好区分。马林界[17]以骏枣为实验原料，比较4 种包装方式在4 ℃和常温贮藏条件下其香气变化的规律。结果发现，铝箔包装的红枣贮藏品质更好，4 ℃贮藏有利于枣果挥发性物质的保留。刘宇星[18]研究不同烘制方式对骏枣香气成分的影响，发现温度过高会引起脂肪酸过度降解，形成不良风味。值得注意的是，在60 ℃下烘制对骏枣果实品质的影响较小。由此可见，针对不同产地红枣香气成分差异的报道较少。顶空固相微萃取技术是一种广泛应用于食品风味分析的非溶剂选择性萃取方法，气相色谱-质谱由于其通用性和较强的定性和定量评价能力，集化合物的分离、鉴定于一体，已成功应用在食品风味鉴定和香气检测[19]。基于此，将该技术应用到不同产地红枣香气成分评价是可行的。

本研究以河南新郑、河南灵宝、陕西榆林、新疆和田、山东德州5 个产地的红枣为实验原料，采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱技术（headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）解析其挥发性风味物质的组成。应用化学计量学方法，如主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA），来深入了解风味特征的变化，筛选出区别红枣地理来源的特征挥发物，从而实现红枣样品的区分。旨在为市售红枣的品质鉴别和产地溯源提供一定的研究支撑，进一步推动枣果产业高质量发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红枣 5 个产地分别是河南新郑大枣、河南灵宝大枣、陕西榆林大枣、新疆和田大枣、山东德州大枣，由当地销售商提供；2-辛醇、氯化钠 纯度均＞99.5%，上海源叶生物科技有限公司。

65 μm PDMS/DVB 顶空固相微萃取头 美国Supelco 公司；TSQ 8000 三重四级杆气相色谱质谱联用仪 赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 顶空固相微萃取 枣果挥发性化合物的提取，使用手动顶空固相微萃取装置进行，参考Liu 等[20]的方法，稍作修改。切分、去核后的枣果，经高速破碎机处理，准确称取2 g 粉碎后的枣果样品置于20 mL顶空瓶，加入2 mL 饱和氯化钠溶液、2 μL 2-辛醇（1 mg/mL，内标物）后密封。在50 ℃恒温水浴条件下平衡40 min，随后，插入65 μm PDMS/DVB 萃取纤维头富集30 min。萃取后，将进样针插入气相色谱质谱仪的进样口，并于250 ℃下解吸5 min。

1.2.2 气相色谱-质谱条件 以氦气（纯度＞99.99%）作为载气，流速1 mL/min，采用不分流模式。待分析物通过DB-5MS 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）实现挥发性化合物的分离。程序升温条件为：GC 色谱初始柱温40 ℃，保持3 min；接着，以4 ℃/min 线性升高到120 ℃，再以6 ℃/min 线性升高到240 ℃，并保持5 min。

质谱数据在EI 电离源、电子能量70 eV 的模式下获得，扫描范围35～550 m/z。离子源和四极杆温度分别230、250 ℃。

1.2.3 化合物的定性与定量 挥发性化合物的鉴定是基于与NIST 2014 文库中纯标准品的质谱和保留时间的比较来确定的。本研究选取香气成分的相似度≥80%进行分析，以2-辛醇作为内标物（浓度为1 mg/mL），枣果中挥发性香气物质的含量计算公式如下：

1.3 数据处理

样品的每组实验重复测试3 次，结果用平均值±标准差来表示。通过SPSS 24 进行单因素方差分析，并通过邓肯多重检验来表示组间显著性差异（P＜0.05）。结合PCA、OPLS-DA，对不同产地红枣的香气物质进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 不同产地红枣挥发性风味物质分析

由表1 可知，5 个产地红枣样品中共鉴定出51 种化合物，包括8 种醇类、12 种酯类、14 种醛类、3 种酸类、5 种酮类、6 种烷烃类、1 种烯烃类和2 种其他类。其中，醛类、酯类和醇类化合物在红枣中更为丰富。不同产地红枣样品中挥发性风味物质的组成和含量存在明显差异，其中，陕西榆林大枣、河南新郑大枣、河南灵宝大枣、山东德州大枣、新疆和田大枣分别鉴定出24 种、19 种、17 种、25 种、34 种挥发物。

表1 不同产地红枣挥发性风味物质Table 1 Volatile flavor substances of jujube from different origins

酯类，与水果味特性有关，多是通过醇类和有机酸的非酶酯化形成的[21-22]。它们中多数以甲酯的形式存在，在不同产地红枣样品中公有的酯类化合物有2 种，分别是己酸甲酯（62.43～220.07 μg/kg）、庚酸甲酯（15.09～125.14 μg/kg）。另外，癸酸甲酯被报道对灰枣的香气有重要贡献[23]。醇类多是由葡萄糖代谢、氨基酸脱羧或多不饱和脂肪酸氧化降解形成的[24]，通常呈现果香味和花香味。在陕西榆林大枣、河南新郑大枣、河南灵宝大枣、山东德州大枣、新疆和田大枣中分别含有5 种、3 种、2 种、3 种、4 种。其中，1-辛烯-3-醇赋予枣果脂肪味、花香味和蘑菇味，且在河南新郑大枣中含量最高（124.66 μg/kg），它可能是由于脂肪酸氧化产生的[25]。值得注意的是，反式-2-癸烯醇、十六醇是新疆和田大枣中特有的醇类，而2-乙基-1-癸醇、2-乙基己醇和2-甲氧基乙醇是陕西榆林大枣中所特有的醇类。醛类被认为可能是由于芳香前体的氧化降解产生，如脂肪酸水解、糖苷水解和美拉德反应[26]。在陕西榆林大枣、河南新郑大枣、河南灵宝大枣、山东德州大枣、新疆和田大枣中分别含有10 种、6 种、7 种、8 种、11 种。其中，苯甲醛呈现出苦杏仁味、焦糖味、麦芽味的香气特征；（E）-2-辛烯醛呈现坚果味、脂肪味。这些挥发性化合物在红枣的香气呈现中起着重要作用。有研究表明，（E）-2-己烯醛和苯甲醛被认为是红枣中的主要香气活性物质，尽管苯甲醛的含量较低，但是发挥了香气叠加或协同作用，使红枣的整体香气更容易被感知[27]。通常来说，酮类化合物多是由还原糖和氨基酸降解或不饱和脂肪酸氧化产生的[28]。特别是，新疆和田大枣中酮类的含量最高。从红枣样品中，共检测到酸类化合物3 种，其中，乙酸的含量最为丰富。低分子质量的羧酸有助于枣果的酸味及刺激性气味[29]，尤其是乙酸，对于红枣的香气贡献较大，这与张富县等[30]报道的结果是相似的。

2.2 不同产地红枣化学计量学分析及差异挥发性化合物的确定

PCA 是一种简化数据分析的方法，通过正交变换将多个变量转化为少数综合变量，以代表原始变量的信息，该方法可以有效地识别数据中“占主导地位”的元素和结构，消除噪声和冗余，降低原始复杂数据的维数，从而更好地揭示复杂数据背后的简单结构[31-34]。如图1 所示，可以直观地显示不同产地红枣风味物质的差异，当样本之间的距离越近时，差异性越小，而距离越远，则差异性越大。根据PCA 得分图上样品各点的离散度和聚集分布，可以看出新疆和田大枣（HT）、陕西榆林大枣（YL）分别位于PC1和PC2 正向、PC1 和PC2 反向，表明其挥发性物质的整体差异较大。同时，前两个PC 的累积贡献率达70.5%（PC1 的贡献率44.9%，PC2 的贡献率25.6%），证明该结果是可靠的。为进一步验证结论的准确性，本研究以鉴定出的51 种挥发性风味物质为自变量（X），以不同产地为因变量（Y）进行OPLS-DA 模型分析。得到模型的自变量拟合指数R2X（cum）值为0.988，因变量拟合指数R2Y（cum）值为0.983，模型预测指标Q2（cum）为0.963，表明该模型的结果是可靠的。从图2 可以看出，不同产地的红枣样品被成功地区分开，该模型结果与PCA 分析基本一致。其中，河南灵宝大枣（LB）位于t[1]反向和t[2]正向区域，新疆和田大枣（HT）位于t[1]和t[2]反向区域，陕西榆林大枣（YL）位于t[1]正向和t[2]反向区域，山东德州大枣（DZ）位于t[1]和t[2]正向区域。而河南新郑大枣（XZ）的3 次平行样品之间分散程度明显，并距离陕西榆林大枣（YL）样品较近，说明两样品之间的香气成分较为相似。

图1 不同产地红枣挥发性风味物质主成分分析Fig.1 Principal component analysis of volatile flavor substances in jujube from different origins

图2 不同产地红枣挥发性物质正交偏最小二乘判别分析Fig.2 Orthogonal partial least squares discriminant analysis of volatile substances in jujube from different origins

在同时满足预测变量重要性投影（variable importance for the projection，VIP）＞1.0，P＜0.05 的条件下，从不同产地鉴定的挥发性有机物中，共筛选出13 种差异挥发物（见表2），包括己酸甲酯、庚醛、庚酸甲酯等，这些化合物赋予红枣独特的脂肪味、柑橘味、甜味等。根据筛选出的差异挥发性物质，绘制出不同产地红枣的PCA 载荷图（见图3）。前两个PC 的累积贡献率为71.1%，其中，4-氨基-1-戊醇、己醛、苯甲醛位于PC1 正向和PC2 反向区域，与河南灵宝大枣（LB）的相关性较高；1-辛烯-3-醇、己酸甲酯、癸酸甲酯位于PC1 反向和PC2 正向区域，与山东德州大枣（DZ）、河南新郑大枣（XZ）的相关性较高；2-甲氧基乙醇、乙酸位于PC1 和PC2 反向区域，与陕西榆林大枣（YL）的相关性较高；壬醛、庚醛、庚酸甲酯、反式-2-己烯醛、反式-2-辛烯醛位于PC1 和PC2 正向区域，与新疆和田大枣（HT）的相关性较高。综上，1-辛烯-3-醇、己酸甲酯、癸酸甲酯可作为山东德州大枣（DZ）、河南新郑大枣（XZ）的特征标记物，赋予枣果独特的蘑菇味、水果味、甜味；4-氨基-1-戊醇、己醛、苯甲醛可作为河南灵宝大枣（LB）的特征标记物，赋予枣果独特的杏仁味、焦糖味和青草味。

图3 不同产地红枣差异挥发性物质的载荷图Fig.3 Load diagram of differential volatiles of jujube from different origins

表2 红枣中差异挥发性化合物及香气特征描述Table 2 Description of differential volatile compounds and aroma characteristics in red jujube

3 结论

本研究采用HS-SPME-GC-MS 结合化学计量学方法，对5 个不同产地红枣挥发性香气成分进行了全面分析。在红枣样品中共鉴定出51 种化合物，其中醛类、酯类和醇类是主要的挥发物。同时，在不同产地的红枣样品中也存在着各自特有的香气成分，如反式-2-癸烯醛仅在陕西榆林大枣中检测到，而戊酸甲酯仅在新疆和田大枣中检测到。通过化学计量学分析，筛选出13 种差异风味物质（VIP＞1，P＜0.05），赋予红枣浓郁的柑橘味、甜味、水果味等香气特征。其中，4-氨基-1-戊醇、己醛、苯甲醛可作为河南灵宝大枣的特征标记物，而乙酸、2-甲氧基乙醇可作为陕西榆林大枣的特征标记物。这些结果揭示了5 个不同产地红枣的挥发物组成和香气特征，为红枣的产地溯源和鉴定提供了有力的依据。