超声辅助NaCl 浸泡对熟化黑豆结构和消化特性的影响

胡秀发，陈燕美，张喜玲，顾辰琦，李 曼，宁阳阳，关纬超，郑婵敏，董茗洋，胡 蝶，杨庆余,

（1.沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳 110034；2.辽宁省粮食和物资储备事务服务中心，辽宁沈阳 110001；3.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110866）

黑豆是豆科植物大豆的黑色种子，富含丰富的蛋白质、淀粉、脂肪、维生素、卵磷脂、黑色素等营养物质[1]。黑豆的微量元素中，维生素B 和维生素E 的含量较高，可以降低血液中胆固醇水平[2]。黑豆中含有大量的抗性淀粉（RS）、慢性消化淀粉[3]（SDS）和易消化淀粉[4]，可以预防和治疗代谢综合征、Ⅱ型糖尿病和冠心病等慢性疾病[5]。黑豆中脂肪主要为不饱和脂肪酸。人体对不饱和脂肪酸的消化率高达95%。黑豆具有较强的适应性，可以在干旱的盐碱地上生长[6]，在我国黑龙江、南海、东海和新疆、陕西、山西等地分布广泛。超声波是一种弹性的机械振荡波，具有波长短、近似直线传播等特点[7]。超声波在固体和液体环境条件下比电磁波衰减更小，能形成高强度声场并产生剧烈震动[8]，超声可加速离子在溶液中的运动速度[9]。经过热处理后，可消除黑豆部分抗营养因子，增加香气值，去除豆腥味，同时还能改善产品外观和适口性，提高利用率。

NaCl 是一种效果较好的抗褐变剂，已在鲜切苹果、鲜切马铃薯等果蔬中应用[10]。Zhi 等[11]研究表明，钠离子存在的情况下，抗性淀粉表面正电荷会增加，可能会改善它们与带负电酶位点的静电相互作用，NaCl 浸泡会降低淀粉消化率。但是对于NaCl浸泡处理对黑豆结构和消化特性的作用和机理研究鲜有报道，因此本研究从NaCl 浸泡影响黑豆结构和消化特性出发，从多角度探究NaCl 对黑豆结构和消化特性的机理。

本研究采用超声辅助NaCl 浸泡黑豆，探究超声辅助NaCl 浸泡对黑豆结构和性质的影响规律，揭示处理后黑豆的结构和消化特性之间的关联机制，为黑豆低升糖食品的综合利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑豆 市售；α-淀粉酶（4000 U/g）枣庄全鼎生物科技有限公司；盐酸 黄骅市鑫盛化工有效公司、NaCl 廊坊鹏彩有限公司；3,5-二硝基水杨酸（DNS） 北京酷来博科技有限公司；以上试剂均为分析纯。

TENSON Ⅱ 傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker 公司；X’pert pro X-射线衍射仪 荷兰帕纳科公司；NHITACHIS-4800 扫描电子显微镜 日本日立高科技公司；DSC-Q20 差示扫描量热仪 美国TA 仪器公司；CT3-4500 型质构仪 美国博勒飞公司；BSA224S-CW 型电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司；FW80 型粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；GFL-125 型热风干燥机 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；722 型紫外可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；HH-6 型数显恒温水浴锅上海皓庄仪器有限公司；SB-25-12DT 超声清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 挑选大小均一、颗粒饱满的黑豆，准确称取黑豆样品30.00 g。将黑豆清洗干净，用吸水纸擦干表面水分，将称好的黑豆分别置于0%、1%、3%、5%（m/v）的NaCl 溶液中，将其放置于超声设备中超声处理，料液比为1:3（g/mL），浸泡温度45 ℃，超声条件为：超声功率400 W，超声时间8 h。将超声浸泡后的黑豆置于沸水中蒸煮30 min，在45 ℃条件下烘干12 h，直至样品干燥。将黑豆样品置于粉碎机中粉碎，过100 目筛得到黑豆粉备用。0%、1%、3%、5%（m/v）的NaCl 溶液浸泡的黑豆分别表示为BB-0、BB-1、BB-3、BB-5。

1.2.2 傅里叶红外光谱分析 参考董茗洋等[12]的方法，准确称取少量样品（约3.00 g）放入干燥箱中，45 ℃下干燥8 h。然后准确称取2.00 mg 干燥好的黑豆粉末，用压片机将样品压片，压力保持15 kPa。测试范围为4000～500 cm-1，扫描累加32 次，分辨率为4 cm-1。

1.2.3 X-射线衍射分析 参考Yang 等[13]研究方法稍加修改，准确称取烘干后黑豆粉末2.00 mg，利用X-射线衍射仪测定黑豆样品的结晶特性，靶型：Cu，检测波长15 nm，扫描范围5°～50°，扫描速度10°/min。采用Origin 对光谱进行基线校正，并使用Origin 对峰进行分配和整合。采用MDI Jade 9.0 软件对样品的结晶度进行分析。相对结晶度的计算方法如下：

式中，AC和 An分别表示结晶区域和无定型区域，XC为相对结晶度。

1.2.4 微观结构的观察 参考白婷等[14]的方法并稍作修改，将黑豆粉末样品真空冷冻干燥，准确称取黑豆粉2.00 mg，采用扫描电子显微镜对其进行微观结构观察，将黑豆粉样品用导电胶固定在样品盘上，放入离子溅射镀膜仪中，对样品进行喷金处理，采用放大率500 倍到5000 倍不等，施加电压为10.0 kV。观察样品的微观结构。

1.2.5 热力学特性测定 参考董茗洋等[12]的研究方法并稍作修改，准确称取黑豆粉末3.00 mg 样品于铝锅样品皿中，加入6.00 μL 蒸馏水，密封在铝锅中，在室温下平衡过夜。一个密封的空铝锅作为参考。测试温度从20 ℃升温至120 ℃，升温速率为10 ℃/min。

1.2.6 吸水率和膨胀率的测定 吸水率和膨胀率测定参考张丽平等[15]的方法，稍作改动。称取30 g（m0）的黑豆颗粒样品，料液比1:3（g:mL），400 W 超声，浸泡温度45 ℃，浸泡8 h 后取出，确保黑豆完整，用厨房纸吸干表面水分，称量其质量（m1），用量筒分别测定黑豆浸泡前后的样品体积V0（浸泡前）和V1（浸泡后），计算黑豆的吸水率和膨胀率，其计算公式如下：

1.2.7 黑豆硬度测定 参考李鹏[16]描述方法并稍作修改，利用质构仪（TPA）对单个黑豆进行硬度分析，选探头为TP10 圆柱形探头。测定参数如下：测试前速度、测试速度、测试后速度设置为2.0 mm/s，压缩比50%，起始感应力5 g，两次压缩时间间隔为5 s。每个样品重复3 次，求其平均值。

1.2.8 糊化度的测定 参考李鹏[16]的研究方法并稍作修改，称取黑豆粉末样品0.4 g 于50 mL 烧杯中，向烧杯中分别加入25 mL 的蒸馏水和0.1 gα-淀粉酶，将其摇晃均匀后将烧杯放入37 ℃的恒温水浴锅中水浴加热1.5 h。取1 mL 1 mol/L 的盐酸溶液加入烧杯中将淀粉酶灭活，将混合溶液分别移至50 mL 容量瓶中，滴加蒸馏水进行定容。用滤纸对混合溶液进行过滤。用加入淀粉酶液的蒸馏水作为对照。取稀释后的样品溶液1 mL 放入试管中，加入2 mL 的DNS 溶液，在沸水浴中加热2 min，取出后冷水冷却至室温，再定容至15 mL，摇匀后在540 nm 的波长下测量吸光度，每个样品测量三次取平均值。用标准葡萄糖曲线代替吸光度值，以确定还原糖的数量。根据公式计算样品的糊化度：

式中：α为糊化度（%）；A 为预熟化后还原糖的含量（mg）；B 为预熟化前还原糖的含量（mg）；C 为完全糊化后还原糖的含量（mg）。

1.2.9 体外消化测定

1.2.9.1 葡萄糖标准曲线的测定 参照赵凯等[17]的方法稍作调整，采用3,5-二硝基水杨酸比色法，先配制 1 mg/mL 的葡萄糖标准液，分别在15 mL 刻度试管中加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的标准液，加入蒸馏水补足1 mL，使浓度分别为 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL；加入 2 mL DNS 试剂，沸水浴2 min 后用冷水迅速冷却，将溶液补足至15 mL，摇匀；于540 nm 波长下测定吸光度,以吸光度值为横坐标（X）、葡萄糖浓度为纵坐标（Y）绘制标准曲线。

1.2.9.2 淀粉体外消化率的测定 参照Goñi 等[18]的方法并稍加修改，精确称取黑豆样品1.5 g，将其放入50 mL 的锥形瓶中，加入30 mL 0.1 mol/L 的磷酸缓冲溶液（37 ℃预热）、1 mL 37 ℃预热的α-淀粉酶溶液，轻轻摇晃均匀，用玻璃棒搅拌15 s，加入6 mL胃蛋白酶-瓜尔胶溶液，用4 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液冲洗干净，用2 mol/L HCl 溶液调到pH1.5，放入转子，然后设置37 ℃进行磁力搅拌，转速320 r/min，保温30 min。将10 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液加入上述溶液中，利用50% NaOH 溶液调节pH6.9；加入200 μL MgCl2-CaCl2溶液、125 μL 胰酶溶液、400 μL淀粉转葡萄糖苷酶，补充蒸馏水至50 mL，在37 ℃摇床中保温180 min（200 r/min）；在不同时间（0、10、20、30、45、60、90 和 120 min）取1 mL 样品放入含有4 mL 无水乙醇溶液中（预热至60 ℃），沸水浴灭酶后自然冷却，8000 r/min 离心10 min，取上清液。DNS 溶液测定还原糖的方法。参照 GB 5009.9-2016《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》测定总淀粉含量计算淀粉的水解率。

1.3 数据处理

所有样品均重复测试3 次，取其平均值。数据采用SPSS26 软件进行统计分析，显著性P＜0.05，采用Origin2020 软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 超声辅助NaCl 浸泡对熟化黑豆分子结构的影响

图1 展示了超声辅助NaCl 浸泡对黑豆红外光谱的影响规律。由图1 可知，在3650～3200 cm-1处为淀粉的O-H 伸缩振动峰，2918～1449 cm-1处为葡萄糖单元C6上-CH2-的伸缩振动。1450～1300 cm-1归属于C-O 的伸缩振动。1660 cm-1附近归属于水的弯曲振动，可能由于超声的空化作用、机械作用和热效应共同作用下，黑豆表皮形成微孔通道[19]，水分子进入细胞与淀粉中的羟基结合[20]。1646～1664 cm-1代表α-螺旋结构，1615～1637 和 1682～1700 cm-1代表β-折叠结构，1664～1681 cm-1代表β-转角结构，1637～1645 cm-1代表无规卷曲结构[21]。表1 展示了不同NaCl 浸泡对黑豆蛋白二级结构变化规律，由表1 可以看出，β-折叠和β-转角含量逐渐增加，α-螺旋和无规卷曲含量逐渐减少，可能是NaCl 浸泡使黑豆中蛋白质结构发生了变化，蛋白质分子的伸展破坏了它的螺旋结构，阻止了多肽链的反转，从而使α-螺旋转化为伸展的β-转角结构。尚加英[22]证明了NaCl 的加入使α-螺旋结构向β-转角结构转变。本研究发现黑豆红外光谱无新吸收峰出现，说明NaCl 与黑豆未发生化学反应，未产生新的官能团和化学键。

表1 不同NaCl 浸泡黑豆蛋白二级结构变化情况Table 1 Secondary structure changes of black bean protein soaked in different NaCl solution

图1 不同NaCl 浓度浸泡对黑豆红外光谱的影响Fig.1 Effects of soaking in different NaCl concentrations on the infrared spectra of black beans

2.2 超声辅助 NaCl 浸泡对熟化黑豆晶体结构的影响

图2 展示了NaCl 浸泡对黑豆结晶特性的影响。由图2 可知，黑豆原淀粉的结晶度为15.10%，BB-1、BB-3、BB-5 的结晶度分别为7.23%、9.65%、10.32%。研究结果表明，热处理引起黑豆淀粉结晶度降低，黑豆淀粉有序结构受到破坏，无定型区域增加[23]。随着NaCl 浓度增加，黑豆淀粉的结晶度呈升高的趋势，在超声的空化作用、热效应和机械作用联合作用下，加速钠离子向黑豆内部扩散，增加了钠离子与淀粉颗粒之间形成盐键的机会[24]，抑制了淀粉结晶区域的破坏。可能是由于蒸煮过程中黑豆淀粉与脂形成淀粉-脂复合物和淀粉-钠盐键共同作用的结果，从而使得淀粉结晶度降低结构受到抑制[25]。

图2 不同NaCl 浓度浸泡对黑豆结晶结构的影响Fig.2 Effects of different NaCl concentration on the crystal structure of black beans

2.3 超声辅助 NaCl 浸泡对熟化黑豆微观结构的影响

超声辅助NaCl 浸泡对黑豆微观结构影响显著。由图3A 可知，黑豆颗粒间隙致密，粘连成团，呈现出团状结构。随着NaCl 浓度的增加，图3D、图3G、图3J 颗粒致密度降低，颗粒之间间隙变大，说明NaCl 浸泡有助于黑豆颗粒的分散，可能是由于NaCl 浸泡使果胶物质溶解，导致细胞颗粒凝聚力减弱[26]。随着NaCl 浓度增高，黑豆颗粒表面变得更粗糙，可能是因为在超声作用下，淀粉颗粒表面受到超声的空化效应和机械效应的结果[13]。在较高NaCl浓度下，黑豆颗粒表面粗糙，NaCl 作为膨胀抑制剂，黑豆淀粉吸水率降低，淀粉吸水胀大受到抑制[27]。

图3 不同NaCl 浓度浸泡对黑豆微观结构的影响Fig.3 Effects of different NaCl concentration on the microstructure of black beans

2.4 超声辅助 NaCl 浸泡对熟化黑豆热特性的影响

由表2 可知，蒸煮后的黑豆粉在70～90 ℃之间没有淀粉的糊化峰，说明蒸煮后的黑豆淀粉已经完全糊化。在100～120 ℃之间有明显的吸收峰，可能是蛋白质变性[28]和淀粉-脂质复合物的特征峰[29]。随着NaCl 浓度升高，焓值呈升高到分别为0.14、1.08、1.12 J/g，可能是钠离子与细胞壁果胶形成复合物，加强细胞壁果胶的紧密性[30]，淀粉糊化需要更高的能量。淀粉双螺旋解旋需要更高的能量，熟化过程使得蛋白质分子之间相互作用降低，蛋白质结构发生改变，部分疏水基团外展，较低热量即可使淀粉分子解旋。黑豆经过热处理，更容易熟化。

表2 不同NaCl 浓度浸泡对黑豆热力学性质的影响Table 2 Effects of different NaCl concentration on the thermodynamic properties of black beans

2.5 超声辅助 NaCl 浸泡对熟化黑豆吸水率和膨胀率的影响

图4 展示了超声辅助NaCl 浸泡对淀粉吸水率和膨胀率的影响。随着NaCl 浓度的升高，黑豆粉的膨胀率呈升高趋势，比清水浸泡分别升高了28%、48%和56%。说明超声诱导在黑豆表皮形成多个微孔，超声过程加速了水分向黑豆内部的扩散作用[31]，加速了黑豆淀粉吸水膨胀。高浓度NaCl 溶液，黑豆粉吸水率变化不显著。可能是高浓度的NaCl 颗粒会附着在黑豆表皮，阻碍水分的扩散，从而使吸水速度变慢。刘阳等[32]研究碳酸氢钠浸泡会阻碍水分的扩散，抑制绿豆吸水速度。

图4 不同NaCl 浓度浸泡对淀粉吸水率和膨胀率的影响Fig.4 Effects of different NaCl concentration on water absorption and expansion rate of starch

2.6 超声辅助 NaCl 浸泡对熟化黑豆硬度的影响

图5 为超声辅助NaCl 浸泡对黑豆硬度的影响。由图5 可知，随着NaCl 浸泡浓度的增加，黑豆硬度呈现降低趋势，盐溶液的浸泡对黑豆细胞组织起到了软化作用，浸泡过程中NaCl 溶液中钠离子可能使黑豆中原有交联果胶的二价矿物质溶出，黑豆硬度降低[33]。超声诱导黑豆表皮形成微孔通道，加速NaCl 分子向黑豆内部渗透，黑豆颗粒吸水膨胀，蛋白质空间结构发生变化引起黑豆硬度降低[26]。NaCl 浸泡后的黑豆，蛋白质结构受到破坏[34]。

图5 不同NaCl 浓度浸泡对黑豆硬度的影响Fig.5 Effects of different NaCl concentration on the hardness of black beans

2.7 超声辅助 NaCl 浸泡对熟化黑豆糊化度的影响

图6 为超声辅助NaCl 浸泡对黑豆糊化度的影响。由图6 可知，随着NaCl 浸泡浓度的增加，黑豆糊化度呈现上升趋势。淀粉的糊化需要经历受热膨胀、双螺旋解旋、溶胀吸水等过程[35]。清水浸泡后的黑豆糊化度为38%，在1%、3%和5%的NaCl 浸泡条件下，黑豆粉糊化度分别为40%、43%、45%。可能是由于NaCl 溶液使黑豆中果胶等物质溶出，加速黑豆软化，蒸煮后黑豆更容易糊化。在超声空化效应等作用下，黑豆表皮形成微孔通道，有利于黑豆淀粉与水分子的结合，淀粉充分吸水膨胀[36]，有利于黑豆糊化现象发生。

图6 不同NaCl 浓度浸泡对黑豆糊化度的影响Fig.6 Effects of different NaCl concentration on the gelatinization degree of black beans

2.8 超声辅助 NaCl 浸泡对熟化黑豆体外消化率的影响

图7 为不同NaCl 浓度浸泡对黑豆消化特性的影响。由图7 可知，经120 min 体外消化，清水浸泡的黑豆淀粉消化率为25.95%，经超声辅助浸泡后的黑豆，BB-1、BB-2、BB-3 中黑豆淀粉消化率分别下降到19.05%、17.93%和17.48%。随着NaCl 浓度的升高，黑豆淀粉消化率呈逐渐降低趋势，α-淀粉酶在弱酸条件下带正电荷，钠离子吸附在黑豆淀粉表面，阻碍了黑豆淀粉和α-淀粉酶接触，这与Zhi 等[11]的研究结果一致。在钠离子存在的情况下，淀粉表面正电荷的增加会增加黑豆粉与淀粉酶的静电排斥作用，这些静电相互作用改变了淀粉酶活性部位构象，降低了淀粉酶与底物结合的能力，从而导致淀粉消化速率降低[37]。

图7 不同NaCl 浓度浸泡对黑豆消化特性的影响Fig.7 Effects of different NaCl concentrations on the digestion characteristics of black beans

3 结论

通过对超声辅助NaCl 浸泡黑豆的结构和消化特性的研究发现，超声和NaCl 均可改善黑豆的浸泡效果。随着NaCl 浓度升高，黑豆焓值呈上升趋势，形成了淀粉-脂质复合物；NaCl 浸泡能够抑制黑豆淀粉结晶区域受到破坏，改善了黑豆淀粉的结晶特性；随着NaCl 浓度升高颗粒致密度降低，颗粒间隙变大，黑豆粉颗粒表面变得更加粗糙；黑豆吸水率和膨胀率升高，黑豆硬度呈下降趋势，随着NaCl 浓度增加，糊化度升高。淀粉体外消化率表明，NaCl 对淀粉消化特性有抑制作用。本实验结果表明，黑豆硬度、糊化度和消化特性与NaCl 浓度密切相关，通过本研究可为黑豆低升糖食品的综合利用提供理论基础。