XPO1基因突变的慢性淋巴细胞白血病临床特征及预后研究

韩宜霏，许张娣，吴佳竹，孔祎琳，潘必慧，李 悦，梁金花，申浩睿，尹 华，王 莉，李建勇，徐 卫

南京医科大学第一附属医院血液科，江苏 南京 210029

慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）是一种慢性B 淋巴细胞克隆增殖性疾病，表现为CD5+的成熟B淋巴细胞在外周血、骨髓、淋巴结和脾脏中聚集，具有显著的遗传和临床异质性［1］。近年来，随着分子靶向治疗的飞速发展，如布鲁顿酪氨酸蛋白激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）抑制剂、磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抑制剂、BCL-2 抑制剂等，极大地改善了患者的预后，CLL 的治疗由传统免疫化疗时代逐步进入无化疗时代［2］，但仍有部分患者会出现治疗耐药，预后相对较差。而大规模的测序研究包括二代测序（next-generation sequencing，NGS）越来越多地应用于血液系统肿瘤研究，极大程度上增加了入们对CLL 基因组改变的认识，也逐步揭示了由克隆异质性导致的临床异质性［3］。

目前CLL中多个再现突变的驱动基因已被报道，包括TP53、NOTCH1、SF3B1、BIRC3、MYD88、ATM、XPO1、FBXW7 和POT1 等，并确定克隆演变是驱动疾病进展的重要机制［4-6］。XPO1基因突变存在于多种血液系统肿瘤中，尤其是B细胞淋巴瘤和白血病，包括原发纵隔大B 细胞淋巴瘤（primary mediastinal large B-cell lymphoma，PMBCL）、经典型霍奇金淋巴瘤（classical Hodgkin lymphoma，cHL）、弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）和CLL［7］。在西方国家，XPO1 基因在CLL 中的突变频率为2.4%～8%［8-9］，低于侵袭性B 细胞淋巴瘤。XPO1 基因位于2 号染色体长臂（2p15），其编码的XPO1 蛋白是重要的核输出蛋白，介导含有核输出信号（nuclear export-signal，NES）结构的蛋白由细胞核向细胞质的转运，对维持细胞稳态是必不可少的［10-11］。已知XPO1 常见的热点突变为E571K 或E571G，处于NES 结构域相邻位置［7］。多项研究表明XPO1 E571K 突变可能促进B 细胞淋巴瘤的发生发展［12-13］。鉴于XPO1 基因突变在CLL 致病及发生Richter 综合征过程中具有重要地位，本研究对本中心携带XPO1 基因突变患者的资料进行回顾性分析，增加对我国携带XPO1基因突变的CLL的认识，以期为临床诊治提供帮助。

1 对象和方法

1.1 对象

本回顾性研究纳入了2006 年11 月—2022 年3 月于南京医科大学第一附属医院血液科确诊CLL的543 例患者。纳入标准：年龄≥18 岁；符合《中国慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤的诊断与治疗指南（2018 年版）》［14］的诊断标准；同意参加本研究者。排除标准：样本资料严重缺失。所有患者均进行外周血/骨髓形态检测、骨髓病理免疫组织化学染色、流式细胞术免疫分型、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、免疫球蛋白（immunoglobulin，IG）重链基因重排和CpG+白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）刺激的染色体核型分析等检测。同时，采用PCR法检测免疫球蛋白重链可变区基因（immunoglobulin heavy-chain variable region，IGHV）突变状态和NGS 检测相关基因突变状态。CLL 诊断标准、分期、CLL 国际预后指数（CLL-international prognostic index，CLL-IPI）评分和疗效评估均严格参照《中国慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤的诊断与治疗指南（2018年版）》［14］。本研究已获得南京医科大学第一附属医院伦理委员会审核批准（伦理号：2023-SRFA-272）。所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 XPO1基因检测方法

①样本类型：所有患者均在获得知情同意后抽取新鲜外周血或骨髓液标本。②检测方法：提取单个核细胞，进行分选。采用PCR扩增法检测。③检测深度：1500*。④变异等位基因频率（variation allele frequency，VAF）计算：VAF（%）=突变reads/（突变reads+野生reads）×100%。

1.2.2 随访及预后

本研究随访截止时间为2022 年6 月。随访方式主要为门诊及住院病历查阅和电话咨询。至首次治疗时间（time to first treatment，TTFT）定义为自明确诊断到开始接受治疗的时间；无进展生存时间（progression-free survival，PFS）定义为自首次治疗到疾病进展的时间或末次随访时间；总生存时间（overall survival，OS）定义为自明确诊断到任何原因导致死亡或随访终点的时间。

1.3 统计学方法

采用SPSS 27.0软件进行统计学分析，计数资料用频数和构成比［n（%）］表示。计量资料用中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示。计量资料的组间比较采用t检验分析。生存曲线由Kaplan-Meier 方法构建，各组患者生存曲线比较使用Log-rank 检验。Graphpad Prism 9.4 软件进行生存曲线绘图。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例特征

在543例CLL患者中，根据NGS检测时状态，分为初诊未治（treatment native，TN）患者368例，复发/难治（relapsed/refractory，R/R）患者175 例。15 例（2.8%）患者XPO1基因突变检测阳性，TN、R/R患者的突变率分别为2.4%（9/368）及3.4%（6/175），其中1例患者TN和R/R时均进行了NGS检测，且均检测出XPO1 基因突变。在15 例XPO1 突变患者中，男性占66.7%（10/15），女性占33.3%（5/15）。TN和R/R患者的临床特征见表1。结果显示，无论TN 还是R/R 患者，男性比例均多于女性（TN：55.6%vs.44.4%；R/R：83.3%vs.16.7%），且疾病大多处于RaiⅢ/Ⅳ期，Binet B/C 组。TN 组中位外周血白细胞绝对计数为24.5（8.9，52.7）×109个/L、淋巴细胞绝对计数为17.4（5.6，44.0）×109个/L、血红蛋白为86（76，116）g/L、血小板计数为191（118，200）×109个/L，中位β2-微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）为3.0（2.9，4.2）mg/L和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）为294（198，329）U/L；R/R组中位外周血白细胞计数为28.4（20.2，56.2）×109个/L、淋巴细胞计数为24.1（13.2，52.0）×109个/L、血红蛋白110（91，118）g/L、血小板计数为92（60，139）×109个/L，中位β2-MG 为4.8（3.5，7.6）mg/L和LDH为256（165，388）U/L。

2.2 XPO1突变位点及变异等位基因频率（variation allele frequency，VAF）分析

15 例CLL 患者携带XPO1 突变基因，均为错义突变，且存在热点突变，中位VAF 为35.4%。66.7%的XPO1基因突变发生在外显子15的E571位点，分别为E571K（50%）、E571G（30%）、E571Q（10%）和E571V（10%）（图1A、B）。同时，本研究发现，R/R CLL组相较于TN CLL组，XPO1的VAF略高，但两者差异并无统计学意义（图1C）。此外，在CLL患者中XPO1突变并不是一个孤立的克隆性突变，XPO1突变常伴随TP53、KMT2D、SF3B1、NOTCH1 和ATM 等基因突变同时发生。图1D～H 展示了在XPO1 突变伴随TP53、KMT2D、SF3B1、NOTCH1 和ATM 基因突变同时发生的患者中，XPO1 与伴随突变基因VAF的比较。鉴于XPO1 基因编码的XPO1 蛋白具有重要的核输出功能，而p53 蛋白是其转运的重要核输出蛋白之一，因此，本研究进一步比较了XPO1基因突变与TP53 基因突变同时出现时的患者临床特征。结果表明，TP53 与XPO1 基因突变同时发生多见于R/R 组（TN：11.1%；R/R：50.0%），在TP53 与XPO1基因突变同时发生的患者中，XPO1的VAF高于TP53 的VAF，但两者差异并无统计学意义（图1D）。1 例患者在R/R 时XPO1 VAF 水平相比TN 时升高，且出现了新的基因突变（ATM、KMT2D 和DDX3X突变）（图1I）。

图1 XPO1基因突变位点和基因突变的VAF Figure 1 XPO1 mutation locus and VAF of gene mutations

2.3 XPO1突变患者的分子和遗传学特征

在15 例患者中，11 例（73.3%）患者IGHV 无突变，4 例（26.7%）患者IGHV 有突变，4 例（26.7%）患者染色体为复杂核型（≥3 个异常染色体）。发生XPO1 基因突变患者的分子和遗传学特征见表2。在TN 组中，XPO1 基因突变常伴随NOTCH1、SF3B1、KMT2D 和ARID1A 基因突变发生，25.0%的患者FISH 可见ATM 缺失、37.5%的患者可见13q 缺失，并无患者存在17p 缺失。而在R/R 组中，XPO1基因突变常伴随TP53、KMT2D 和ATM 基因突变发生，且60.0%的患者FISH 可见ATM 缺失和13q 缺失，40.0%的患者可见17p 缺失。TN 组中位突变数目为4，R/R组中位突变数目为5（图2）。

图2 15例携带XPO1突变的CLL患者队列中基因突变、分子和遗传学特征分布Figure 2 Distribution of gene mutations，molecular and genetic characteristics in the cohort of 15 CLL patients with XPO1 mutations

表2 15例XPO1突变CLL患者遗传学和分子特征Table 2 Genetic and molecular characteristics of 15 CLL patients with XPO1 mutations

2.4 XPO1突变对治疗及预后的影响

在15 例XPO1 突变患者中，除3 例未达到治疗指征，其余12例已经接受治疗。对于9例TN患者，3例患者目前处于观察等待期，3例患者已接受治疗并获得部分缓解（partial response，PR），2 例患者治疗后获得完全缓解（complete response，CR），1 例患者治疗后转为难治。而对于6 例R/R 患者，在疾病进展后，均进行BTK抑制剂（伊布替尼或泽布替尼）治疗，4例患者获得缓解；2例患者疾病控制不佳，其中1例患者在泽布替尼治疗耐药后出现中枢受累，另1 例患者则发生了Richter 综合征，均已死亡（图3A）。截至2022年6月，XPO1突变组患者中位TTFT为1.8个月，中位PFS为19.8个月，中位OS为40.0个月；XPO1 无突变组患者中位TTFT 为8.1 个月，中位PFS 为32.5 个月，中位OS 为49.8 个月。两者TTFT（P=0.633）、PFS（P=0.394）和OS（P=0.799）差异均无统计学意义（图3B～D）。TN 时XPO1 突变组和无突变组采用BTK 抑制剂化疗的总反应率（overall response rate，ORR）为100.0%vs.80.5%（P=0.651）。R/R 时XPO1 突变组和无突变组采用BTK 抑制剂化疗的ORR 为66.7%vs.56.0%（P=0.927）。另外，26.7%（4/15）的患者发生了Richter综合征。

图3 15例携带XPO1突变的CLL患者治疗情况、疗效评估、生存结局和预后等特征分布Figure 3 Distribution of treatment status，efficacy evaluation，survival outcome and prognosis of 15 CLL patients with XPO1 mutations

3 讨论

XPO1 基因突变广泛存在于各种实体瘤和血液系统肿瘤中，而重现性E571位点突变多发生在B细胞恶性肿瘤中。CLL是一种常见的B淋巴细胞克隆增殖性疾病。2011 年，Puente 等［9］通过全外显子测序首次揭露了重现性XPO1基因突变在CLL中的致病作用。目前国外已有针对XPO1 基因突变与CLL患者临床特征的相关性研究，但国内尚缺乏相关报道。国外研究显示，XPO1 基因突变频率为2.4%～8%［8-9］。在本中心数据中，XPO1突变也是一个低频突变，突变率低于3%，略低于国外。此外，XPO1基因突变均为错义突变，且中位VAF为35.4%。

目前越来越多的突变复杂性/肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）评估将XPO1突变纳入其中，通过评估TMB来预测CLL患者预后。如2018年Nadeu 等［15］将28 个CLL 相关驱动基因测序，并说明TMB 与CLL 患者较短的无治疗生存（treatment-free survival，TFS）相关。2021年Chauzeix等［16］研究显示ATM、SF3B1、NOTCH1、XPO1、MYD88、TNFAIP3 和TP53组成的基因模型可以较好预测较短的TFS，甚至对Binet A期的患者也能准确预测。由此可见XPO1基因突变在CLL患者预后评估中具有重要意义。

在CLL 患者中，XPO1 突变与高危预后指标相关。2015 年西班牙的一项2 493 例CLL 队列中，XPO1突变和TP53突变一样，存在于ATM缺失患者中，该类患者预后不佳［17］。Puente等［9］也发现XPO1突变主要存在于IGHV无突变的CLL患者。本研究结果与之一致，绝大多数XPO1 基因突变患者为IGHV无突变，其TTFT相比IGHV有突变患者更短，且60%的R/R患者存在ATM缺失。本研究还发现，R/R 患者一线治疗采用传统免疫化疗，但均未获得持续缓解。这部分患者末次治疗选用BTK抑制剂，2/3 患者获得缓解，未获得缓解的2 例患者中1 例同时伴随TP53 和BTK（C481S）突变。而TN 患者一线治疗采用BTK 抑制剂联合/不联合化疗的患者均获得缓解，这也提示以BTK抑制剂为基础的治疗对携带XPO1基因突变的患者有效。

关于XPO1 基因突变的预后意义，目前尚有争议。Jain等［8］认为XPO1基因突变是低频突变，且对伊布替尼有效，可能并不是CLL 的不良预后因素。而2021年欧洲血液协会（European Hematology Association，EHA）会议报道了一项4 674 例CLL 队列的回顾性研究，则认为XPO1 突变与TTFT 较短相关。2023年Moia等［18］最新研究显示，在仅纳入早期CLL患者的组中，XPO1 突变是TTFT 较短的预测因子。XPO1 突变的CLL 原代细胞的染色质可及性相比XPO1 野生型的CLL 原代细胞更高，可及性增加的染色质区域富含B 细胞受体（B cell receptor，BCR）信号通路中转录因子的结合位点，如NF-κB等。在转录层面上，XPO1 突变的CLL 原代细胞还存在MYB和MIR1HG等基因的过表达，这些基因会刺激BCR 的活性。在本研究中，CLL 患者中位TTFT 为5.2个月，相对较短，这与EHA会议报道和Moia最新研究一致。XPO1基因突变预后意义差异可能与以下4 个因素相关：①XPO1 突变率检测差异；②样本量的差异；③随访时间的差异；④纳入CLL 患者的亚组选择。截至随访结束，6 例R/R XPO1 突变CLL患者中有2例患者在疾病进展后采用BTK抑制剂治疗后仍出现疾病进展，1 例患者发生了Richter 综合症（表2 中P13 患者：IGHV 无突变、β2-MG 升高，分期晚，NGS 可见XPO1、ATM、ARID1A、KMT2D 和FBXW7基因突变），采用BTK 抑制剂联合RTX 并未取得缓解；另1 例患者采用泽布替尼治疗耐药（表2中P12 患者：TP53 异常、β2-MG 升高，分期晚，NGS可见XPO1、TP53、BTK、SF3B1 和MGA 基因突变），后出现中枢浸润。2例患者均在短时间内死亡。因此尽管BTK 抑制剂对多数XPO1 突变患者有效，但仍有部分患者不能克服。此外，本研究注意到，15例CLL 患者中有4 例发生了Richter 综合症，3 例在TN时确诊，其中2例分别采用BTK抑制剂/BCL-2抑制剂联合化疗并序贯自体造血干细胞移植，获得完全缓解。另1 例患者即将启动治疗。1 例在R/R 时确诊，采用BTK抑制剂联合RTX并未取得缓解。

一些研究表明XPO1 是CLL 的有效靶标，且核输出蛋白抑制剂塞利尼索可以延缓CLL 模型小鼠的疾病进展，增加总体生存率［19-20］。也有研究认为，XPO1 突变可能会增加肿瘤细胞对XPO1 抑制剂的敏感性，从而增加XPO1 抑制剂的细胞毒作用［7］。Hing 等［21］研究发现塞利尼索对伊布替尼耐药和携带BTK C481S 位点突变的CLL 模型小鼠有效，同时可以和伊布替尼具有协同作用，可以增加小鼠的总体存活率。对于携带XPO1 突变的R/R 患者，如BTK 抑制剂单药治疗效果不佳，联合XPO1 抑制剂或许是一种新型治疗模式。

目前而言，XPO1 突变在CLL 中似乎并不能提示更差的预后，其为低频突变，且常伴随其他基因突变。在R/R 患者中，XPO1 突变发生率高于TN 患者。对于极其难治患者及发生Richter 综合征的患者，XPO1抑制剂联合靶向治疗或许是治疗的新选择。