高效液相色谱法测定试验鸡肉中水飞蓟宾含量

侯泽桦，李羡钰，孙雯可，谢艾伶，刘全瑞，刘鼎阔，于晓雪 ，李留安

（1.天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392；2.鼎正新兴生物技术（天津）有限公司 天津市生物饲料添加剂企业重点实验室，天津 300383）

水飞蓟宾（silybin，SLB）是菊科植物水飞蓟果实提取物的主要生物活性物质，是天然的黄酮木质素类化合物[1]，其已有上千年的药用历史。研究表明，水飞蓟宾具有保肝、抗肿瘤、抗炎、抗代谢功能失调等多种生物活性功能[2-3]，广泛应用于医药领域。鸡肉具有低脂肪、高蛋白的特点，是国民膳食中肉类的重要组成部分。功能性食品是指具有特定营养保健功能的食品，即具有调节机体功能、不以治疗为目的的食品。功能性食品形式多种多样，如饮料、冲剂、烘焙制品等[4]，鸡肉也可作为功能性食品的一种。检测功能性食品中活性物质含量对于保证营养供给和品质检测是非常必要的。目前国内外关于水飞蓟宾含量的测定研究多集中在植物提取、医药等方面。石万银等[5]利用高效液相色谱法测定得到水飞蓟提取物中水飞蓟宾的含量不低于20%。周旖璇等[6]通过建立高效液相色谱法测定大鼠血浆中水飞蓟宾的含量，测得水飞蓟宾在大鼠体内的消除半衰期为（9.9±0.9）h。但目前国内外关于动物产品中水飞蓟宾含量检测方法未见报道。本研究通过在鸡基础饲粮中添加水飞蓟宾，获得富含水飞蓟宾的鸡肉，并建立高效液相色谱法检测试验鸡肉中水飞蓟宾含量的方法，以期为后续开发含水飞蓟宾的功能性鸡肉及其有效含量检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验鸡肉样品：天津农学院实训基地。将135 只鸡随机分为3 组，每组45 只。第1 组为对照组，饲喂基础饲料；第2 组在基础日粮中添加0.5%（质量分数）的水飞蓟宾；第3 组在基础日粮中添加1%（质量分数）的水飞蓟宾。30 d 后每组随机抽取10 只鸡进行屠宰采集鸡肉，置于-20 ℃备用。

水飞蓟素（纯度≥98%）：陕西云奇生物科技有限公司；水飞蓟宾标准品（纯度95.7%）：中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯）：德国Merck 公司；乙酸乙酯（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（1260）：安捷伦科技有限公司；超声波清洗机（SB-100D）：宁波新芝生物科技股份有限公司；旋转蒸发仪（IKA RV 10）：上海予申仪器有限公司；多用途涡旋混合器（VORTEX-6）：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；电子分析天平（FB223）：上海舜宁恒平科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件的优化

参照《中华人民共和国药典》2020 版一部[7]中水飞蓟宾含量测定方法的高效液相色谱条件进行优化。色谱柱：Agilent-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为水∶甲醇= 43∶57、47∶53、53∶47（体积比）；流速：0.65、0.70 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：288 nm；进样量：20 μL。

1.3.2 标准溶液配制

标准储备液：准确称取水飞蓟宾标准品20 mg 于50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到400 μg/mL 水飞蓟宾溶液，取400 μg/mL 水飞蓟宾溶液250 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀放置备用，所得水飞蓟宾标准储备液浓度为10 μg/mL。

标准工作液：依次吸取0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mL 水飞蓟宾标准储备液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，得到系列浓度为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL的水飞蓟宾标准工作液。

1.3.3 标准曲线绘制

将配制好的0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL 的标准工作溶液参照1.3.1 的液相色谱条件进行分析，以水飞蓟宾的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到水飞蓟宾的标准曲线线性回归方程。

1.3.4 精密度测定

用1 μg/mL 的标准工作液，重复测定6 次，计算精密度。

1.3.5 样品前处理

称10 g 鸡肉样品剪碎置于50 mL 离心管中，加入20 mL 乙酸乙酯，涡旋混匀，超声30 min，以10 000 r/min离心10 min，上清液经滤纸过滤置于圆底烧瓶中，90 ℃旋转蒸发，2 mL 甲醇复溶，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，待高效液相色谱仪检测。

1.3.6 回收率测定

精密称取10 g 空白鸡肉样品9 份，将浓度为0.5、1.0、2.5 μg/mL 的标准工作液分别加入样品中，每个浓度3 份，每份加1 mL，按1.3.5 方法进行处理，测得峰面积，代入标准曲线方程，算出实际浓度，计算回收率。

1.3.7 鸡肉样品测定

按照1.3.5 方法对试验鸡肉样品进行处理，按照1.3.1 色谱条件进行测定。样品中的水飞蓟宾含量根据标准曲线方程进行换算。

1.4 数据处理

试验数据均以平均值±标准差表示。采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，用单因子方差分析（one-way analysis of variance，One-way ANOVA），并采用Duncan法进行多重比较，进行组间显著性分析，P<0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

色谱基本条件的优化见表1。

由表1 可知，有机相比例越大，保留时间越短，在水飞蓟宾A、B 两峰分离完全的前提下，当水与甲醇体积比为47∶53 时，保留时间最短。当流速提高到0.70 mL/min，由于柱压过大，检测程序终止。为使两峰完全分离，准确定量检测水飞蓟宾，最终选用色谱条件为水∶甲醇=47∶53（体积比），流速0.65 mL/min，柱温30 ℃，检测波长288 nm，进样量20 μL。

2.2 标准曲线

水飞蓟宾标准曲线见图1。

图1 水飞蓟宾标准曲线Fig.1 Standard curve of silybin

由图1 可知，水飞蓟宾标准曲线方程为y=95.16x-0.875 3，相关系数R2=0.999 6，表明水飞蓟宾标准品浓度在0.1~5.0 μg/mL 时与峰面积线性关系良好。

2.3 检出限和定量限

以峰高为3 倍平均信噪比时的浓度为检出限（limit of detection，LOD），以峰高为10 倍平均信噪比时的浓度为定量限（limit of quantitation，LOQ），计算得本方法的LOD 和LOQ 分别为0.022 μg/g 和0.073 μg/g。

2.4 精密度测定

精密度试验结果见表2。

表2 精密度试验结果Table 2 Precision test results

由表2 可知，此方法相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.89%，表明精密度良好。

2.5 回收率测定

样品加标回收率如表3 所示。

表3 样品加标回收率Table 3 Recovery rate of samples with added standard substance

由表3 可知，水飞蓟宾的平均回收率在88.45%~104.34% 之间，相对标准偏差最大为2.94%。该结果表明，本检测方法具有良好的回收率。

2.6 标准品和鸡肉样品色谱图

水飞蓟宾标准品和试验样品色谱图见图2。

图2 标准品和样品色谱图Fig.2 Chromatogram of standard substance and sample

由图2 可知，试验鸡肉中水飞蓟宾色谱峰的分离情况和峰形良好，对照鸡肉样品中无目的峰。水飞蓟宾由水飞蓟宾a 和水飞蓟宾b 两个非对映异构体等比例组成，为双峰。

2.7 试验鸡肉样品水飞蓟宾含量测定结果

按照1.3.5 和1.3.1 的方法对试验鸡肉进行前处理和测定，试验鸡肉样品水飞蓟宾含量测定结果如图3所示。

图3 高效液相色谱法检测试验鸡肉中水飞蓟宾含量Fig.3 Determination of silybin in experimental chicken by HPLC

由图3 可知，对照组鸡肉中未检测出水飞蓟宾，0.5% 试验组鸡肉中水飞蓟宾平均含量为（0.167±0.010）μg/g，1.0% 试验组鸡肉中水飞蓟宾平均含量为（0.302±0.033）μg/g，结果表明，在日粮中添加的水飞蓟宾能够在鸡肉中富集，且富集效果与添加比例有关，1.0% 试验组含量显著高于0.5% 试验组（P<0.05）。

3 讨论与结论

水飞蓟素的护肝、抗氧化、免疫调节等多种生物活性功能，使其在保健品、医药行业中被广泛应用。自我国养殖业全面禁抗后，水飞蓟素在畜牧业中展现出较好的应用前景。有研究表明，在饲粮中添加水飞蓟素可有效促进畜禽生长，维护机体健康，有利于抵抗各种不良应激反应[8-9]。Bendowski 等[10]研究发现，在肉鸡的饮用水中添加水飞蓟提取物可促进机体健康，提高生产性能，血清抗氧化能力更强，试验组传染性法氏囊炎发生率显著低于对照组。上述研究均为开发水飞蓟宾作为畜禽饲料添加剂提供了理论基础。此前有在鸡肉中成功富集硒元素的试验，朱梅芳等[11]在灵山土鸡日粮中使用自主配制的红枣富硒饲料，获得了富硒鸡肉和鸡蛋，且改善了鸡肉和鸡蛋的风味。也有关于水飞蓟宾在动物内脏中分布的研究，李秋红等[12]通过给大鼠静脉注射水飞蓟宾葡甲胺盐注射液后，以叔丁基甲醚为提取剂从大鼠心、肝、脾、肺、肾组织匀浆中均检测到了水飞蓟宾，且在体内分布的浓度大小顺序依次为肺、肝、心、肾、脾。但由于水飞蓟宾具有高度疏水性和非电离性的化学结构，导致水飞蓟宾水溶性差，口服生物利用率低[13]，推测其导致水飞蓟宾在机体内富集效率较低。通过将水飞蓟宾制成纳米晶体，有效改善了药物在体内的吸收，提高了生物利用度[14]。

本试验通过在鸡基础饲粮中添加0.5%、1.0% 的水飞蓟宾来获得试验鸡肉样品，结合水飞蓟宾易溶于有机溶剂的特性，以乙酸乙酯作为提取试剂对试验鸡肉进行预处理，建立了一种高效液相色谱测定试验鸡肉中水飞蓟宾含量的方法，在色谱条件为流动相（水∶甲醇=47∶53，体积比）、流速0.65 mL/min、柱温30 ℃时，可在饲粮添加水飞蓟宾后获得的试验鸡肉中检测出水飞蓟宾，此方法操作简便、定量准确、所出色谱峰峰型良好，精密度和回收率较高，为水飞蓟宾在鸡肉中的含量测定提供了方法参考。