四川草地型藏绵羊杂交羊群中FecB基因的检测与分析

陈 勇，杨小林，黄向月，牟 桑，雍 军，余康健，苏元君，李星亮

（阿坝藏族羌族自治州畜牧科学技术研究所，四川 红原 624402）

绵羊的多胎性状是绵羊多产、高产的基础。研究发现，FecB基因是在绵羊身上识别出的第一个高繁殖力主效基因，携带FecB等位基因的绵羊群体的繁殖力显著高于不含有该基因的群体。研究人员对中国很多地方绵羊品种都进行了FecB检测，发现至少9个品种存在FecB突变［1］，主要存在于小尾寒羊和湖羊中。故本研究选用湖羊、小尾寒羊作为母本，分别与草地型藏绵羊（贾洛羊）、萨福克羊公羊进行杂交，后对杂交F1代羊群进行FecB基因检测，计算各基因型的基因频率，并跟踪F1 代母羊的产仔情况，为后期优化、筛选和制订草地型藏绵羊多羔多胎杂交育种计划提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验羊群及血样采集6 个试验羊群分别为湖羊、小尾寒羊、草地型藏绵羊（贾洛羊）等纯系以及草地型藏绵羊（♂）×小尾寒羊（♀）、萨福克羊（♂）×草地型藏绵羊（♀）、湖羊（♂）×草地型藏绵羊（♀）等杂交F1代羊。均饲养于若尔盖县，健康状况良好。

根据羊群数量大小，等比例选取一定数量的羊只采集血样。91只试验羊于颈静脉处采血5～10 mL，加入混有1%肝素钠的抗凝管中，混匀后保存在－20 ℃冰柜中备用［2］。

1.2 试验羊群的饲养管理 试验组的湖羊、小尾寒羊、萨福克羊及其杂交F1 代羊每天放牧约8h；日补饲2次，上午、下午各喂1次；成年羊每天补饲玉米粒0.2 kg/只，补饲全价颗粒饲料0.08 kg/只；羔羊每天补饲玉米粒0.08 kg/只，补饲全价颗粒饲料0.08 kg/只；实行规范化驱虫和免疫预防。对妊娠母羊、产后母羊及羔羊进行精细化饲养管理，对于产羔多但又少奶的哺乳母羊，务必对其羔羊实施人工哺乳，尽量减少羔羊不必要的死亡。

1.3 DNA 提取方法 采用SDS 方法按说明书步骤提取试验羊只血样DNA，电泳检测条带后，保存于－20 ℃备用。

1.4 多羔多胎基因扩增PCR 采用10 μL 体系：DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，2×Easy TaqPCR Super Mix（＋dye）5μL，用ddH2O 补足10 μL。

扩增引物序列参考NY/T 1672-2008 标准，预期扩增片段大小为140 bp。

上游引物：GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG；下游引物：CAAGATGTTTTTCATGCCTCATCAAC ACGGTC。

1.4.1 PCR 扩增体系10 μmol/L 的上下游引物各1μL，SYBR PCRSuperMix 10 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O6 μL，总反应体积为20 μL。

PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33 个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.4.2 PCR 产物检测及测序5 μL 的扩增产物加上1μL上样缓冲液（Loading Buffer），5μL DM2000 DNAMarker，于120 V下电泳30 min，凝胶成像仪下观察产物的扩增情况。

1.5FecB基因型分型 分装5 μL 的PCR 扩增产物送北京擎科生物科技股份有限公司（成都分公司）测序，检测目标位点的碱基多态性。

另取5 μL PCR扩增产物用AvaⅡ限制性内切酶进行酶切，酶切反应体系如下［5］：PCR扩增产物5μL，10×NEBBuffer 5μL，AvaⅡ酶1μL，双蒸水39 μL。整个体系的混合在冰上操作，振荡、离心后置于37 ℃恒温箱中过夜。5 μL 的扩增产物加上1μL 上样缓冲液（Loading Buffer），5μL DM2000DNAMarker，于200V电压下电泳30min，凝胶成像仪下观察产物的扩增情况。

1.6 统计分析 对测序结果和FecB基因酶切结果进行判定、统计，并用卡方检验分析各试验羊群的Hardy-Weinberg平衡情况。统计3个杂交组合羊群母羊的第一胎产羔情况。

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增结果 由图1 可知，在100 bp 和250 bp 之间有1 条特异性扩增片段，与预期扩增片段大小一样，约为140 bp。

图1 FecB基因PCR扩增结果

2.2 PCR-RFLP 检测结果 将扩增产物（A1～C3）酶切，电泳结果显示出3 种不同的基因型，如图2 所示。其中A1、A2、A3 为野生型（++型，无FecB拷贝，140bp/140bp）；B1、B2、B3 为杂合型（B+型，一个FecB拷贝的携带者，140 bp/110 bp）；C1、C2、C3为纯合型（BB型，两个FecB拷贝的携带者，110 bp/110 bp）。

图2 FecB基因扩增产物AvaⅡ酶切结果

2.3 基因分型结果及Hardy-Weinberg 平衡检验 湖羊、小尾寒羊、贾洛羊等纯系样本不符合Hardy-Weinberg平衡条件，故不做卡方检验。

由表1 可见，藏×小F1 代群体中三个基因型频率分别为0.05、0.21和0.74，且野生型（++型）是该群体中的优势基因型。萨×藏F1代群体中没有检测出纯合型（BB 型），只检测出杂合型（B+型）和野生型（++型），二者基因型频率分别为0.20和0.80，且野生型（++型）是该群体的优势基因型。湖×藏F1代群体中没有检测出纯合型（BB型），只检测出杂合型（B+型）和野生型（++型），二者基因型频率分别为0.70和0.30，且杂合型（B+型）是该群体的优势基因型。经卡方（χ2）检验，藏×小、萨×藏、湖×藏组合的P值分别为0.423、0.940、0.232，均大于0.05，说明三个杂交组合F1 代群体满足Hardy-Weinberg平衡条件。

表1 试验羊群多胎基因分型结果与卡方检验

2.4 三个杂交组合F1代母本的产仔数情况 由表2 可知，湖×藏、萨×藏组合的产羔均数分别为1.4、1.1头，低于藏×小组合（2.1头）。

3 讨论

3.1FecB基因的导入情况 产羔数是直接影响养羊业经济效益的重要因素。鉴于草地型藏绵羊繁殖力较低［4］，本研究着力通过杂交方式在草地型藏绵羊中导入FecB基因来提高繁殖力。基因分型结果显示，藏×小F1 代群体中存在三种基因型［7］，即BB 型、B+型和++型，萨×藏F1 和湖×藏F1 代群体中存在两种基因型，B+型和++型，且B+基因型频率分别为0.20、0.70，说明FecB基因已经在草地型藏绵羊3 个杂交群体中导入成功。

3.2 基因型频率分析 研究发现藏×小、湖×藏、萨×藏三个杂交F1 代群体虽未进行人工选择，但均处于Hardy-Weinberg平衡状态。同时，群体内BB 基因型频率较低，分别为0.05、0、0，后期随着杂交群体的自繁、扩群，群体中BB型基因频率逐渐增加［6］，从而不断提高子二代、三代等群体的产仔均数。

3.3 产羔数差异分析 若尔盖县地处青藏高原东北边缘，养殖环境多为高海拔（3 300 m以上）及高寒地区，所以本研究选择已能适应本地区气候环境的绵羊品种（小尾寒羊、萨福克羊、湖羊）和本地草地型藏绵羊（贾洛羊）作为试验对象。小尾寒羊和湖羊是中国知名的产多羔型品种，产羔率平均为229%～270%，一般作为配套组合杂交母本。本研究发现，选择小尾寒羊作为母本，杂交F1 代产羔数量平均为2.2 头。相对应的，以湖羊作为父本，杂交F1代产羔数量平均仅有1.4头，说明以多羔型品种作为母本的杂交（藏×小）F1代的产羔数量明显多于以多羔型品种为父本的杂交（湖×藏）F1代的产羔数量。这一点这与卡那提沙力克［7］报道的结果基本一致。

本研究发现，母本小尾寒羊可能携带有少量野生型（++型）基因，三个杂交组合F1代FecB基因的B 配子的基因频率各不相同，但藏×小、湖×藏杂交F1代组合的B基因型频率分别为0.14、0.11，前者仍高于后者。因此，以小尾寒羊或者湖羊作为杂交母本，其杂交F1 代的FecB基因频率高，更有利于FecB基因在藏绵羊群体中的导入。

4 结论

通过分子生物学手段对草地型藏绵羊与小尾寒羊、萨福克、湖羊等杂交后代群体进行FecB基因分型，发现F1代杂交群体均成功导入了FecB基因，母羊产仔均数有一定的提高。在对比分析不同的杂交组合方式后，确定以多羔型品种绵羊（小尾寒羊）作为杂交组合的母本，其FecB基因聚合优势更大，产羔数更多。