四川地区一株PCV2的分离鉴定及基因组序列分析

陈劲松，郭紫晶，黄雄挺，张志东，李彦敏

（西南民族大学动物医学四川省高等学校重点实验室，四川 成都 610041）

猪圆环病毒2 型（PCV2）属于圆环病毒科圆环病毒属，是环状单链DNA病毒。PCV-2感染后会引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、初生仔猪先天性震颤（CT）［1-3］。PCV2基因组大小为1 767～1 768 nt，包含2个主要的开放阅读框（ORFs），其中ORF1 编码病毒复制相关蛋白Rep，ORF2编码衣壳蛋白（Cap）。PCV2基因组易发生点突变和基因重组，在疫苗免疫和自然感染选择压力作用下，PCV2 流行株持续进化和变异［4-5］。

本研究从四川省某发病猪场病料组织中成功分离并鉴定出一株PCV2毒株（SMU-2022），通过克隆测序获得全基因组序列，并对其进行分子生物学特征分析。

1 材料与方法

1.1 细胞和临床样本 猪肾细胞（PK-15）由本单位实验室保存；从四川省某养猪场疑似PMWS发病猪上采集18 份组织样本，其中3 份肺脏、4份脾脏、3份肝脏、4 份肾脏和4份淋巴结组织，－80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素双抗、DMEM 培养基，购自Gibco 公司；病毒DNA/RNA提取试剂盒、Dream TaqGreenPCR预混液（2×）、胶回收试剂盒，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；PMD-19T 载体，购自Takara 公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；DL2000Marker、质粒提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；PCV2兔源多抗，来自GeneTex 公司；FITC 标记羊抗兔IgG，来自Biosharp 公司；D（＋）-氨基葡萄糖，购自Sigma试剂公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 将收集到的肺脏、脾脏、肝脏、肾脏和淋巴结病料组织在无菌条件下剪碎，每份病料剪取约1 g，置于无菌研磨管中，加入PBS 1 mL和匀浆珠4粒，按照标准研磨程序研磨，4 ℃、10 500 r/min 离心3～5min，吸取上清液，参照DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA。

1.3.2 PCV2的PCR检测 参考文献［6］合成P1检测引物，参考文献［7］合成P2、P3 全基因序列扩增引物（表1）。用P1 引物对提取的DNA 进行PCR扩增。25μL PCR 反应体系：DreamTaq Green PCR预混液（2×）12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板2 μL，无酶水（RNase freewater）8.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

表1 引物序列

1.3.3 病毒的分离 将经PCR 检测为阳性的样品制成组织悬液，离心后取组织上清液用氯仿处理，每1 mL 上清加入50 μL 氯仿，室温下不断混合10 min，2 000 r/min 离心10 min。取上清，用0.22 μm 滤膜过滤。将长成单层的PK-15细胞用0.05%EDTA-胰酶消化液消化，制成细胞浓度为5×104个/mL 的细胞悬液。取上清液1 mL 接种到10 mL细胞悬液，分装到2个25 cm2（T25）细胞培养瓶中，并加300～500 μL 300 mMD（＋）-氨基葡萄糖，置于37 ℃5%CO2培养箱培养；同时培养正常PK-15 细胞作为对照。接种后18～24 h，细胞长成50%～60%单层，用300 mMD（＋）-氨基葡萄糖处理细胞，用预热无菌PBS 液（37 ℃）溶解D（＋）-氨基葡萄糖，溶液经0.22 μm滤膜过滤。弃去培养液，加入1～2mL预热的300 mMD（＋）-氨基葡萄糖。37 ℃孵育30 min，去除D（＋）氨基葡萄糖，用PBS 洗涤细胞，加入含2%FBS 的DMEM维持液，继续培养48 h。按上述步骤将病毒盲传5 代后进行PCR 检测，鉴定为阳性的病毒继续传代。

1.3.4 病毒的PCR 鉴定 收获的每一代次细胞病毒液以P1 为引物，以PCV2 临床阳性样本为阳性对照，同时设立未接毒的PK-15细胞为阴性对照，进行PCR检测。将扩增结果为阳性的PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.5 病毒的间接免疫荧光鉴定 将病毒接种到预先培养的PK-15 细胞上，37 ℃培养48～60 h后弃去培养基，用预冷PBS洗涤2次，晾干；用4%多聚甲醛（溶于PBS 中，pH7.6）室温下固定细胞10min，用预冷PBS洗涤3次，晾干；用0.25%Triton X-100（溶于PBS 中，pH7.6）室温下孵育10min，用预冷PBS洗涤3次，晾干；加封闭液（1%BSA＋含22.52 mg/mL 甘氨酸的PBST）封闭45min，用预冷PBS洗涤3次，晾干；加入兔源PCV2 多抗（1∶500）50 μL/孔，4 ℃孵育过夜，用预冷PBS 洗涤3 次，晾干；加入FITC 标记的羊抗兔IgG（1∶1 000）50 μL/孔，室温下避光孵育1 h，用预冷PBS洗涤3次，晾干；荧光显微镜下观察。

1.3.6 PCV2 全基因组扩增及克隆 根据表1 全基因扩增引物P2、P3 扩增全基因组序列。25 μL PCR 反应体系：Dream TaqGreen PCR预混液（2×）12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，无酶水8.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共36次循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增出的目的条带用DNA纯化回收试剂盒回收，回收产物与pMD19-T 载体连接，导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，最后将鉴定为阳性的单菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.7 遗传进化分析 测序结果经BLAST 比对后进行手动拼接。从GenBank 中选取源于不同国家、不同基因型的PCV2 毒株全基因组核苷酸序列，使用Mega 7.0 和DNAstar 中的Seqman和MegAlign软件对本次分离的PCV2 毒株与GenBank 中PCV2 参考毒株进行全基因核苷酸序列相似性比对；利用Mega 7.0 软件进行遗传进化分析，采用ClustalW方法和Neighbor-Joining（NJ）（Bootstrap，1 000次重复）法构建系统进化树。

1.3.8 PCV2 Cap蛋白的氨基酸序列和抗原指数分析 从GenBank中选取与PCV2分离毒株同源性最高的20 株参考毒株、4 株参考疫苗株进行比对，利用DNAstar 中的MegAlign 和Mega 7.0 软件分析ORF2基因编码的氨基酸序列的相似性。利用DNAstar 中Protean 软件的Anligenicily Jameson-Wolf方法，预测PCV2分离株的Cap蛋白抗原指数，并与4株参考疫苗株（GenBank 号：HM038027.1、HM641752、AY686764、HM038034）的Cap蛋白抗原指数进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 临床样品PCV2 的检测 对采集的18 份疑似PMWS患病猪的临床样本进行PCR检测，结果显示，有3 份样本（脾脏、淋巴结和肾脏）扩增得到大小约537 bp 的目的片段，与预期结果相符（图1）。测序结果进一步表明，这3 份样品均为PCV2阳性。

图1 部分病料组织中PCV2的PCR扩增

2.2 病毒的分离与鉴定 将3份PCV2阳性的组织病料接种到PK-15 细胞上，并连续传代7 次后再次进行PCR检测。结果显示，只有肾脏接种的每一代PK-15 细胞能扩增出特异性PCV2 条带（图2），表明分离到的PCV2能够在PK-15细胞上增殖。与对照细胞相比，PCV2 感染的PK-15 细胞未出现细胞病变效应（CPE）。通过间接免疫荧光检测，在接种PCV2的第7代PK-15细胞中出现特异性绿色染色，阴性对照细胞上没有出现特异性染色。总之，本试验从疑似PMWS患猪的肾脏组织中分离到一株PCV2，命名为SMU-2022。

图2 每一代PK15细胞中PCV2的PCR扩增

2.3 PCV2 基因组扩增及克隆 用引物P2 和P3对分离毒株进行克隆测序，结果显示，在960 bp、980 bp 左右处出现目的电泳条带，扩增结果与预期结果相一致（图3）。将测序获得的2 个基因组序列片段与P1扩增的序列片段进行拼接，得到PCV2（SMU-2022）分离毒株的全基因序列，全长为1767nt，提交至GenBank，登录号为OQ656424。

图3 PCV2的PCR扩增结果

2.4 PCV2分离株的遗传进化分析PCV2分离株（SMU-2022）与国内外46 株PCV2 参考毒株进行全基因组核苷酸序列比对及遗传进化分析，结果显示，PCV2 分离株与国内外46 株参考毒株的相似性为91.8%～99.1%，与我国参考株QZ1410 毒株（江苏，GenBank 号：MG732832.1）的相似性最高，亲缘关系最接近。基于全基因组序列和ORF2基因序列所构建的遗传进化树显示，PCV2 分离株（SMU-2022）属于PCV2d基因型（图4）。

图4 PCV2全基因组（A）和ORF2基因（B）的系统进化树

2.5 Cap蛋白的氨基酸序列和抗原指数分析ORF2基因长为705 bp，编码235 个氨基酸，利用Mega 7.0 软件将分离株的Cap 蛋白氨基酸序列与国内外20个参考毒株进行序列比对，结果得出氨基酸相似性为98.3%～99.1%。与4 株参考疫苗株的氨基酸相似性为81.7%～86%。分析PCV2 分离株（SMU-2022）的ORF2 氨基酸位点，发现在Cap蛋白B细胞表位区有1个特异性突变位点V30L，在T细胞表位区有1个特异性突变位点T232K。

对PCV2 分离株（SMU-2022）的Cap 蛋白与4株疫苗株的Cap 蛋白进行抗原指数分析，结果显示：PCV2分离株与4株疫苗株的抗原指数差异较大，主要集中在第20-30、40-75、90-100、130-140、195-205、210-220 位氨基酸这6 个区域，且PCV2分离株的抗原指数明显高于疫苗株。

3 讨论

3.1 PCV2 在我国的流行情况 根据全基因组序列和ORF2 基因序列分析，PCV2 分为8 种基因亚型（a、b、c、d、e、f、g、h），目前国内流行毒株为PCV2a、PCV2b 和PCV2d 基因亚型［8］。PCV2a 是临床上最流行的基因型，之后发生两次基因型转移，即从PCV2a 到PCV2b再到PCV2d，而PCV2d 已成为中国当前流行的主要基因型［9］。Liu［10］等综合整理2015～2019年间已报道的各地区的PCV2流行情况，发现PCV2总流行率为46.0%，其中东北地区最高，PCV2 流行率最高的是保育猪（50.9%）。集约型农场和粗放型农场的PCV2 感染率分别为50.1%和37.5%。这些结果表明PCV2 在中国猪群中有较高的感染率，给我国生猪养殖业带来了严重的威胁和挑战［11-12］。

本研究从疑似PMWS 发病猪的组织样本中成功分离到一株PCV2（SMU-2022，GenBank 号：OQ656424），该毒株为PCV2d 基因型。通过基因组和Cap 基因序列遗传进化分析，发现该分离株与QZ1410 毒株（江苏，GenBank 号：MG732832.1）的亲缘关系密切，但是其PCV2d基因组在进化树上单独分为一支。相似性分析显示，该毒株与国内外46株参考毒株的核苷酸相似性为91.8%～99.1%，表明PCV2毒株基因型正在不断变异和进化。

3.2 Cap 蛋白抗原性分析Cap 蛋白作为PCV2唯一的结构蛋白，包含与病毒免疫相关的主要抗原决定性表位及中和表位（47-87aa、113-147aa、165-200aa、230-233aa），决定了PCV2 抗原性和致病性［13-15］。Cap蛋白氨基酸序列的微小变化也会改变构象，影响病毒与受体的结合以及病毒的免疫逃避［16］。此外，Cap 蛋白还参与调节宿主生物过程、病毒复制和运输等［15］。

当前国内猪场接种的商品化疫苗多基于PCV2a 和PCV2b 基因型研发，在临床防控PCV2的流行和传播方面仍然有效。但是，在疫苗免疫的选择压力下PCV2 基因亚型的变异速度加快，新的流行毒株可能会破坏疫苗保护效力，故应加快研制针对当前流行毒株的疫苗。

4 结论

本研究从四川地区某发病猪场的临床样本中成功分离到一株PCV2 流行毒株，该毒株为当前主要流行的基因型——PCV2d。该毒株的Cap蛋白氨基酸序列存在2 个突变位点，抗原指数与当前市场疫苗株的差异较大。本研究结果为四川省PCV2的遗传进化分析和疫苗株的筛选提供了数据支撑。