姜黄素介导的骨髓间充质干细胞外泌体对 ACC-M细胞增殖、迁移和侵袭的影响

程 昊，吴发印，刘智丹

(遵义医科大学第五附属（珠海）医院口腔颌面外科，珠海 519100)

腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）约 占头颈部恶性肿瘤的1%，是最常见的唾液腺恶性肿瘤，多发生于唾液腺组织，其特点是侵袭性强，经常发生血行转移，淋巴结转移较为罕见[1]。ACC 的预后较差，治疗方式的进步对ACC 的治疗结果没有明显影响，患者长期生存期低与复发转移密切相关[1-2]。ACC 的治疗通常为根治性手术切除和术后放疗，同时针对ACC 患者的靶向分子治疗也被广泛研究，但该病缓慢的病程限制了其临床疗效[3]。目前，迫切需要研究新的治疗方法来提高ACC 患者的治疗效果。外泌体是由45 个多泡体内部囊泡与质膜融合而成的纳米囊泡，大量的研究[4]已经证实，外泌体在ACC 的发生、发展中具有重要的作用。最近研究[5]发现，中药介导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）外泌体在治疗癌症上具有很大的治疗潜力。然而中药介导的BMSCs 外泌体在治疗ACC 上的作用还不清楚，其中姜黄素是被证实的具有抗肿瘤功效的中药[6]，本研究将通过体外实验探究姜黄素介导的BMSCs 外泌体对调控ACC-M 细胞增殖的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞

ACC-M 细胞（货号：bio-105915）和人BMSCs（货 号：bio-090476）购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 药物与主要试剂

姜黄素（纯度：95%；上海源叶生物科技有限公司，中国）；DMEM 培养液（上海瑞永生物科技有限公司，中国）；肿瘤易感基因101（TSG-101）、CD63、CD9、重组人钙连蛋白（calnexin）、上皮钙黏素（E-cadherin）、神经钙黏素（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、转化生长因子β1（TGF-β1）、细胞外信号调节激酶（ERK）抗体、磷酸化-细胞外信号调节激酶（p-ERK）（Abcam 公司，英国）；二抗（上海西宝生物科技股份有限公司，中国）；细胞计数试剂盒-8（CCK8）（爱必信生物科技有限公司，中国）；transwell 小室（北京杰辉博高生物技术有限公司，中国）；多聚甲醛（南京化学试剂股份有限公司，中国）；TRIzol 试剂（成都化夏化学试剂有限公司，中国）；引物的设计和合成均由上海碧云天有限公司提供。

1.3 仪器

SpectraMax i3x 多功能酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司，中国）；StepOneTM实时荧光定量PCR仪（应用生物系统公司，美国）；Ts2R/Ts2 倒置显微镜（上海千欣仪器有限公司，中国）。

1.4 方法

1.4.1 药物处理与分组 参考文献[7]的方法，使用7.5 μmmol/L 的姜黄素与BMSCs 细胞共培养72 h 后，收集培养液，离心后收集上清液，并按文献方法分离外泌体并进行鉴定。ACC-M 细胞培养在DMEM培养液中，并将ACC-M 随机分为4 组：control 组、BMSC-Exo 组、Cur-BMSC-Exo 组和Cur 组。Control 组 为正常培养的ACC-M 细胞；BMSC-Exo 组为使用未经姜黄素处理的BMSCs 外泌体160 μg/mL（本研究在预实验姜黄素处理的BMSCs 外泌体浓度筛选中，发现浓度为160 μg/mL 时，ACC-M 细胞存活率接近50%，因此后续选择此浓度进行实验）与ACC-M细胞共培养；Cur-BMSC-Exo 组使用姜黄素处理的BMSCs 外泌体160 μg/mL 与ACC-M 细胞共培养；Cur 组为用7.5 μmmol/L 的姜黄素处理ACC-M 细胞，所有分组培养48 h 后进行后续实验。

1.4.2 外泌体的分离与鉴定[5]使用DMEM 培养液培养人BMSCs，待BMSCs 汇合度至80%后，使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗细胞，然后将BMSCs 细胞培养在不含血清的DMEM 的培养液中。培养2 d 后，离心机分离并收集细胞培养液，在过滤后进行超速离心，收集沉淀后使用PBS 进行溶解，然后使用蛋白质印迹法（Western blotting）检测外泌体标志性蛋白。

1.4.3 Western blotting[8]使用RIPA 裂解液提取各组ACC-M 细胞总蛋白，并使用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒检测蛋白质浓度，然后经垂直电泳分离蛋白后，进行转膜。使用脱脂牛奶进行封闭。然后加入一抗TSG-101（1∶1 000）、CD63（1∶1 000）、CD9（1∶1 000）、calnexin（1∶1 000）、E-cadherin（1∶10 000）、N-cadherin（1∶5 000）、vimentin（1∶1 000）、TGF-β1（1∶1 000）、p-ERK（1∶1 000），4 ℃下孵育过夜，然后使用0.1%PBS 进行冲洗后，加入二抗（1∶2 000），然后加入增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显色液进行显影，然后进行拍照和灰度值分析。

1.4.4 CCK-8 实验[9]收集细胞，将ACC-M 细胞接种于96 孔板中，接种密度为4×103个/孔，进行分组处理后培养48 h，之后每孔加入10 μL 的CCK-8试剂，继续在37 ℃培养箱中孵育2 h 后使用酶标仪检测吸光度值，并计算细胞存活率，计算公式：细胞存活率=（处理组吸光度值-空白组吸光度值）/（对照组吸光度值-空白组吸光度值）×100%。

1.4.5 Transwell 实验[10-11]收集各组细胞，调整密度为1×105个/mL，并在小室的上室加入无血清培养液，且每孔加入200 μL 的细胞，然后在小室的下室每孔加入600 μL 含有10%胎牛血清的培养液，并在37 ℃培养箱中继续培养48h，使用多聚甲醛进行固定，20 min 后使用0.1%的结晶紫进行染色，20 min 后显微镜下观察细胞迁移数目。侵袭实验：将Matrigel 加入到transwell 小室的上室中，在上室中加入100 μL 无血清的培养液，室温下静置0.5 h后弃培养液，在上室加入200 μL 的细胞，在下室加入600 μL 的培养液（含10%血清），培养48 h 后，使用4%的多聚甲醛对滤膜进行固定20 min 后使用苏木精对其染色10 min。之后擦去表面上非侵袭性的细胞，最后通过显微镜观察并计数。

1.4.6 实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）[12]使 用TRIzol 试剂提取ACC-M 细胞总RNA，并检测提取的RNA 的浓度，将RNA 反转录为cDNA，然后配制荧光定量RCR 反应体系，并以GAPDH 为内参，进行PCR 反应。最后根据2-ΔΔCt法分析TGF-β1和ERK mRNA 相对表达量。TGF-β1 引物序列：F，5'-GGATACCAACTATTGCTTCAGCTCC-3'；R，5'-AGGCTCCAAATATAGGGGCAGGGTC-3'。ERK引物序列：F，5'-CAGAGATTGAGACTGCGTGGC-3'；R，5'-AAGGAACCGGATCCCACATC-3'。GAPDH引物序 列：F，5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'；R，5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。

1.5 统计学方法

使用SPSS 26.0 软件对所有数据进行分析，正态分布的数据均以均数±标准差（±s）表示，每组重复5 次，2 组之间比较使用t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体的鉴定

Western blotting 实验检测外泌体中外泌体标志物TSG-101、CD63、CD9 和calnexin 的蛋白表达，结果如图1 所示。与cell 组比较，外泌体组（BMSC-Exo组和Cur-BMSC-Exo 组）中TSG-101、CD63、CD9 蛋白高表达，而calnexin 蛋白呈低表达，表明成功获得外泌体。

图1 Western blotting 检测外泌体标志物的表达Figure 1 Expression of exosome markers detected by Western blotting

2.2 Cur-BMSC-Exo 对ACC-M 细胞存活率的影响

CCK-8 检测培养48 h 后ACC-M 细胞存活率，control 组、BMSC-Exo 组、Cur-BMSC-Exo 组、Cur 组 的细胞存活率分别为（100.00±2.53）%、（96.78± 3.75）%、（67.21±5.15）%和（80.22±4.65）%。与 control 组比较，BMSC-Exo 组ACC-M 细胞存活率无明显变化（P＞0.05）；与BMSC-Exo 组比较，Cur-BMSC-Exo 组和Cur 组ACC-M 细胞存活率均显著降低（P＜0.05），且Cur-BMSC-Exo 组细胞活力下降水平显著高于Cur 组（P＜0.05）。详见图2。

图2 CCK-8 检测培养48 h 后ACC-M 细胞存活率Figure 2 Survival rate of ACC-M cells after 48 h of culture detected by CCK-8 assay

图3 Transwell 实验检测各组细胞迁移情况Figure 3 Cell migration in each group detected by transwell experiment

图4 Transwell 实验检测各组细胞侵袭情况Figure 4 Cell invasion in each group detected by transwell experiment

2.3 Cur-BMSC-Exo 对ACC-M 细胞迁移的影响

Transwell 实验检测各组细胞迁移情况，结果如图3 所示。control 组、BMSC-Exo 组、Cur-BMSC-Exo组、Cur 组的迁移细胞数分别为（100.40±2.61）、（97.89±2.12）、（62.63±1.60）、（82.95±1.21）个。与control 组比较，BMSC-Exo 组细胞迁移无明显变 化（P＞0.05）；与BMSC-Exo 组比较，Cur-BMSCExo 组和Cur 组ACC-M 细胞迁移数目均明显降低（P＜0.05）；与Cur-BMSC-Exo 组比较，Cur 组细胞迁移数量增加（P＜0.05）。

2.4 Cur-BMSC-Exo 对ACC-M 细胞侵袭的影响

Transwell 实验检测各组细胞侵袭情况，结果如 图4 所 示。Control 组、BMSC-Exo 组、Cur-BMSCExo 组、Cur 组的细胞侵袭数分别为（120.40±8.87）、（117.80±9.02）、（62.00±8.88）、（90.00±7.88）个。与control 组比较，BMSC-Exo 组侵袭数量差异无统计学意义（P＞0.05）；与BMSC-Exo 组比较，Cur-BMSC-Exo 组和Cur 的细胞侵袭数量均明显降低（P＜0.05）；与Cur-BMSC-Exo 组比较，Cur 组细胞侵袭数量显著增加（P＜0.05）。

2.5 Cur-BMSC-Exo 对ACC-M 细胞迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

由图5和表1可见，与control组比较，BMSC-Exo组E-cadherin、N-cadherin 和vimentin 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与BMSC-Exo 组比较，Cur-BMSC-Exo 组和Cur 组的E-cadherin 蛋白表达水平均显著增加，而N-cadherin 和vimentin 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），且Cur-BMSC-Exo 组和Cur 组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组细胞迁移和侵袭相关蛋白表达情况（±s,n=5）Table 1 Expression of migration and invasion-related proteins in each group (±s,n=5)

表1 各组细胞迁移和侵袭相关蛋白表达情况（±s,n=5）Table 1 Expression of migration and invasion-related proteins in each group (±s,n=5)

①表示P＜0.05，与BMSC-Exo 组比较；②表示P＜0.05，与Cur-BMSCExo 组比较。

图5 各组细胞迁移和侵袭相关蛋白表达情况Figure 5 Expression of migration and invasion-related proteins in each group

2.6 Cur-BMSC-Exo 对ACC-M 细 胞TGF-β1/ERK通路的影响

由图6 和表2 可见，与control 组比较，BMSC-Exo 组TGF-β1 和ERK mRNA 相对表达量和蛋白表达水平均无明显差异（P＞0.05）；与BMSC-Exo 组比 较，Cur-BMSC-Exo 组 和Cur 组 的TGF-β1、ERK mRNA，TGF-β1、p-ERK 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），且Cur 组mRNA 水平和蛋白水平显著高于Cur-BMSC-Exo 组（P＜0.05）。

表2 各组细胞TGF-β1/ERK 通路相关基因表达情况（±s,n=5）Table 2 Expression of TGF-β1/ERK pathway-related proteins in each group (±s,n=5)

表2 各组细胞TGF-β1/ERK 通路相关基因表达情况（±s,n=5）Table 2 Expression of TGF-β1/ERK pathway-related proteins in each group (±s,n=5)

①表示P＜0.05，与BMSC-Exo 组比较；②表示P＜0.05，与Cur-BMSC-Exo 组比较。

图6 各组细胞TGF-β1/ERK 通路相关蛋白表达情况Figure 6 Expression of TGF-β1/ERK pathway-related proteins in each group

3 讨论

外泌体被定义为是在细胞通信和疾病中发挥重要作用的细胞外囊泡，几乎所有种类的哺乳动物细胞都分泌脂质双层囊泡，由包括癌细胞在内的多种真核细胞释放的外泌体，对肿瘤的侵袭和转移具有调控作用[13-15]。因此，外泌体在癌症进展中具有关键作用，它们不仅可以作为癌症诊断和预后的生物标志物，而且还可以作为药物传递载体和可重构的治疗系统。姜黄素是从姜黄根茎中提取的多酚类药物，具有抗炎、抗肿瘤等功效，然而由于姜黄素具有水溶性差、渗透性较差等缺点，姜黄素的药用价值大打折扣[16]。近年来关于外泌体作为载药系统提高中药疗效的研究已备受关注[17]。外泌体作为药物载体可在多种疾病中发挥重要作用。有研究[18]表明，外泌体因其天然良好的稳定性，以及能较好地穿越脑血屏障的特点，在脑部疾病中可作为良好的载 体。此外，外泌体作为载体在中药治疗肿瘤中也具有不可忽视的作用，如张婷等[19]在研究中发现，姜黄素预处理的外泌体可通过诱导细胞凋亡减缓肝癌的进程。然而关于姜黄素预处理的外泌体是否对ACC-M 细胞也具有显著的作用，此前学界还不清楚。

不少学者[20]已经证实间充质干细胞可通过分泌因子发挥对疾病的治疗作用。本研究通过体外培养将姜黄素与人BMSCs 共培养，然后将载有姜黄素的BMSCs 外泌体与ACC-M 细胞共培养，结果发现，载有姜黄素的BMSCs 外泌体与ACC-M 细胞培养后，ACC-M 细胞的存活率、迁移及细胞数均明显减少，提示载有姜黄素的BMSCs 外泌体可以发挥显著的抑癌作用；同时还发现载有姜黄素的BMSCs 外泌体处理组对ACC-M 细胞活力、迁移和侵袭能力的抑制作用显著高于单独使用姜黄素处理组，提示以BMSCs 外泌体为载药载体可增强姜黄素对腺样囊性癌的疗效。

本研究发现，携带姜黄素的BMSCs 外泌体可显著降低TGF-β1 和p-ERK 蛋白表达水平，表明携带姜黄素的BMSCs 外泌体可能通过调节TGF-β1/ERK 信号通路发挥抑癌作用。有研究[21]已经证实，TGF-β1/ERK 信号通路的激活会加速肿瘤的进展，且诱导多种促癌蛋白的发生；相反，TGF-β1/ERK 信号通路的抑制可明显抑制肿瘤的转移速度[22]。我们的研究结果与先前学者的报道[21]相似。

综上所述，我们发现人BMSCs 分泌的外泌体可作为姜黄素的载体抑制ACC-M 细胞的增殖和转移，并调控TGF-β1/ERK 信号通路。本研究为今后间充质干细胞源性外泌体治疗ACC 提供参考。然而本研究仍然存在不足之处，外泌体作为载药系统对姜黄素药用价值的提高效率仍需进一步确定。