姜酮酚纳米乳液制备工艺优化及其稳定性研究

刘梦梦，郭时印，肖 航，覃静萍，范 伟，唐忠海*

（1 湖南农业大学食品科学技术学院 长沙410128 2 麻省大学阿莫斯特分校食品科学系 美国阿莫斯特01003 3 湖南省菜籽油营养健康与深度开发工程技术研究中心 长沙 410128）

乳液[1]是热力学上不稳定的胶体分散体，由2种不相容的液体组成，其中一种液体（次要成分）在表面活性剂存在下以液滴的形式分散到其它液体（主要成分）中[2-4]，根据粒径、稳定性可以将乳液分为常规乳液、纳米乳液和微乳液[5]，纳米乳液粒径范围<200 nm[1]。极小的液滴尺寸有各种潜在好处：如高光学透明度，对颗粒聚集和重力分离具有很高的稳定性以及提高包埋功能组分的生物利用度等[6-7]。超声乳化是制备纳米乳液的一种高能量方法，基于空化现象，超声波会产生高温、高压、强剪切力和机械力。用超声波产生的乳状液中纳米级液滴的尺寸比用其它机械装置制备的乳状液多分散指数低，而且相对稳定，同时该方法具有操作简单、成本低、安全、无毒等特点[8]。

生姜的块茎含有多种化学成分[9-10]，主要含3类：挥发油类、姜辣素（包括姜酚类、姜烯酚类、姜酮类、姜二酮类、姜二醇类等不同类型）、二苯基庚烷[11]。姜酮酚（6-Paradol）[12-14]是由姜中的姜烯酚生物转化产生的不饱和酮[15]。有研究表明姜烯酚会在体内代谢为姜酮酚[16]，也有研究表明姜酮酚具有很强的抗氧化、抗炎和黄嘌呤氧化酶抑制活性[17-19]，同时具有较为可观的降血糖、抗癌、凋亡和神经保护活性、减肥等作用[20-21]。然而，由于姜酮酚是一种脂溶性化合物，水溶性极差且结构中存在不饱和酮，该部位容易发生脱水、热解及发生氧化反应，单独经口服摄入后体内生物利用度很低。此外，姜酮酚具有的辛辣刺激特性在很大程度上限制了其在食品与医药领域的应用。

近几年，为提高脂溶性天然活性成分（如类胡萝卜素、姜黄素、黄酮、VE 等）的生物利用度[22]，越来越多的研究者开始设计食品级纳米乳液传递系统，尤其是水包油乳液。纳米乳液作为递送体系，可显著提高脂溶性化合物的溶解性并提高其输送效率，在改善人类健康方面显示出很大的应用潜力[23-24]。目前关于姜酮酚的研究较少，也未见姜酮酚纳米乳液超声制备的相关报道，本文采用超声技术，通过单因素实验和正交试验优化姜酮酚纳米乳液制备条件，并对其稳定性能进行评价，为姜酮酚产品开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

姜酮酚样品（HPLC 纯度≧95%），济南名可生物科技有限公司；原香菜籽油（食品级），道道全粮油股份有限公司；吐温85（食品级），山东优索化工科技有限公司；大豆卵磷脂，浙江一诺生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SCIENTZ-IID 超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；集热式恒温磁力搅拌浴，郑州长城科工贸有限公司；电子天平，福州华志科学仪器有限公司；冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；激光共聚焦显微镜，德国蔡司公司；浊度计，上海昕瑞仪器仪表有限公司；Zetasizer Nano ZS 纳米粒度仪，马尔文仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 姜酮酚溶解度 准确称取一定质量的菜籽油，加入过量的姜酮酚，充分混匀后恒温超声1 h。超声完成后，将油溶液加入1.5 mL 离心管中，以14 000 r/min 离心20 min，取上清液，以空白菜籽油为对照，利用酶标仪在波长284 nm 处测定吸光值，根据标准曲线进行定量。

1.3.2 标准曲线 参考Davidov-Pardo 等[25]的方法，精确称取0.2 mg 姜酮酚样品溶解在20 g DMSO 中，配制得0.01 mg/g 的叶黄素标准液，准确稀释 得含量 为0.04，0.035，0.03，0.025，0.02，0.015，0.01 mg/g 的姜酮酚标准液，利用酶标仪在284 nm 测定吸光值。以质量比为横坐标，吸光值为纵坐标，做标准曲线。

1.3.3 纳米乳液的制备 在使用超声波设备制备纳米乳液之前，进行如下预乳化处理：将水相缓慢地滴加到油相中，同时在磁力搅拌器上搅拌10 min。在预乳液形成后，使用超声细胞破碎仪制备纳米乳液。超声产生的乳液中纳米级液滴的尺寸比其它机械装置制备的乳液的多分散性更小，也相对更稳定[26]，乳液制备的简易流程见图1。

图1 乳液制备流程图Fig. 1 Flow chart of preparation of emulsion

图2 姜酮酚标准曲线Fig. 2 Standard curve of 6-paradol

1.3.4 纳米乳液的制备优化

1.3.4.1 乳化剂质量分数 将4%菜籽油与0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的Tween 85 或卵磷脂混合，加入95.5%，95.0%，94.5%，94.0%，93.5%的去离子水。油相与水相混匀后用磁力搅拌器搅拌10 min 得粗乳液，之后将粗乳液在超声功率（250 W）下超声15 min 得纳米乳液，所有乳液样品转移至离心管中，4 ℃储存，之后测定乳液的粒径和PDI。

1.3.4.2 超声功率 将1.0%的Tween 85 或卵磷脂与4%菜籽油混合，与95%水相在磁力搅拌器上搅拌10 min 得粗乳液，之后将粗乳液在100，200，250，300，400、500 W 下超声9 min 得纳米乳液，所有乳液样品转移至离心管中，4 ℃储存，之后测定乳液的粒径和PDI。

1.3.4.3 超声时间 将1.0%的Tween 85 或卵磷脂与4%菜籽油混合，与95%水相在磁力搅拌器上搅拌10 min 得粗乳液，之后将粗乳液在250 W 下超声3，9，15，21，27 min 得纳米乳液，所有乳液样品转移至离心管中，4 ℃储存，之后测定乳液的粒径和PDI。

1.3.4.4 芯材质量分数 将0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%的姜酮酚加入到菜籽油中，充分混匀后加入吐温85（或卵磷脂），与水相混匀用磁力搅拌器搅拌10 min 得粗乳液，之后将粗乳液在250 W下超声9 min 得纳米乳液，所有乳液样品转移至离心管中，4 ℃储存，之后测定乳液的粒径和粒径分布。

1.3.5 正交优化 根据单因素实验的结果，选择超声时间、超声功率和姜酮酚质量分数作为变量，设计三因素三水平的正交试验对制备条件进行优化，按表1 进行正交优化试验。

表1 正交因素水平表Table 1 Table of orthogonal factor levels

表2 正交优化结果Table 2 The results of orthogonal optimization experiments

表3 纳米乳液的基本性质Table 3 The characteristics of nanoemulsion

1.3.6 粒径测定 将得到的乳液取样后，用去离子水稀释100 倍，采用纳米粒度及Zeta 电位分析仪Zetasizer Nano ZS 测量其粒径大小以及多分散系数（Polydispersity Index，PDI）。

1.3.7 浊度测量 用散射光浊度计在室温（25±0.5）℃条件下测量纳米乳的浊度，每份样品测量重复3 次。

1.3.8 微观结构观察 利用激光共聚焦显微镜观察纳米乳液的微观结构[26]，测样前将100 μL 尼罗红染料加入2 mL 样品中，混合均匀，滴加在载玻片上，盖上盖玻片，采用63 倍物镜倒置观察。所有图像均用仪器软件程序拍摄和处理。

1.3.9 包埋率 参考Davidov-Pardo 等[25]的方法，将乳液在DMSO 中稀释100 倍（与溶解度测定条件保持一致），利用酶标仪在波长284 nm 处测定吸光值。

1.3.10 储藏稳定性和离心稳定性

1.3.10.1 离心稳定性[27]取1.5 mL 的纳米乳液加入到离心管中，加盖密封，于室温5 000 r/min 分别离心0，5，10，15，20 min 观察相分离情况。

1.3.10.2 储藏稳定性 新鲜制备的姜酮酚纳米乳液在25 ℃和4 ℃下储存1 个月。储存时间对纳米乳液稳定性的影响以7 d 为间隔通过物理观察、粒径来确定。

1.4 数据处理

所有的试验均重复3 次，试验结果以平均值±标准偏差表示。采用Origin 2018、Photoshop CC 2019 软件进行基础数据处理并制图。

2 结果与分析

2.1 姜酮酚溶解度

姜酮酚需要先溶解于油相中，再与水相混合通过超声制备纳米乳液，在油相中的溶解度限制了芯材的载量，故首先测定姜酮酚在菜籽油中溶解度[28]。通过标准曲线计算可知（y=5.1857x-0.0031，R2=0.9994），姜酮酚在菜籽油中的溶解度为138.9 mg/g 左右。

2.2 乳化液制备单因素实验

2.2.1 乳化剂质量分数的选择 水包油纳米乳液体系由水、油和乳化剂3 部分组成，为了形成水包油乳液，使用的乳化剂是亲水诱导的表面活性剂[29-31]。分别选用卵磷脂[32-33]（天然的生物两亲性化合物）和吐温85（非离子表面活性剂）作为乳化剂制备纳米乳液。结果如图3 所示，使用吐温85 制备的乳液随着乳化剂质量分数增加，乳液粒径不断减小，在乳化剂质量分数为1%时，粒径达到了（149.4±0.7）nm，此 时PDI 最低为0.13。同 时Sondari 等[29]的研究结果也表明吐温85 的质量分数越高，纳米乳的粒径越小。Ghosh 等[30]发现表面活性剂浓度与液滴大小成反比，与稳定性直接相关。使用卵磷脂制备乳液时，在乳化剂质量分数为1%时，乳液粒径为（249.3±2.03）nm，此时PDI 最低为0.39，在质量分数达到1%之后，粒径并没有随着乳化剂质量分数增加而有明显变化。有研究者发现过量卵磷脂会降低乳液稳定性并导致存在囊状卵磷脂聚集体[34]。综上所述，选择乳化剂质量分数为1%进行后续试验。

图3 乳化剂质量分数对纳米乳液平均粒径和PDI 的影响Fig. 3 The impact of emulsifier mass fractionon the mean droplet diameter and PDI of nanoemulsion

2.2.2 超声条件对乳液粒径的影响

2.2.2.1 超声功率 如图4 将粗乳液在100，200，250，300，400，500 W 下超声15 min，试验结果表明：使用吐温85 制备的乳液在功率为250 W 时，粒径达到（146.9±2.18）nm，PDI 为0.127±0.004；使用卵磷脂制备的乳液在250 W 时，粒径达到（250.8±2.09）nm，PDI 为0.396±0.011；在400 W时，粒径是（232.1±0.98）nm，PDI 为0.320±0.002。试验结果表明粒径和PDI 并不简单的随超声功率增大而减小，施加的过量超声能量或存在的过量表面活性剂质量分数对液滴性质产生不利影响[35-36]。综上，选择超声功率250 W 进行后续试验。

图4 超声功率对纳米乳液平均粒径和PDI 的影响Fig. 4 The impact of ultrasonic power on the mean droplet diameter and PDI of nanoemulsion

2.2.2.2 超声时间 如图5 在250 W 下超声3，9，15，21，27 min 得纳米乳液，在超声15 min时，吐温85 和卵磷脂制备的乳液粒径分别达到了（147.5±1.17）nm 和（248.0±4.55）nm，PDI 为0.114±0.005 和0.38±0.008；有研究者通过超声乳化15 min 制备出液滴直径为29.3 nm 的稳定罗勒油纳米乳[30]。结果表明随着超声时间的增加液滴直径稍有减小，乳液粒径略有减小，超声到达15 min时发现粒径趋于平稳或略有增加。

图5 超声时间对纳米乳液平均粒径和PDI 的影响Fig. 5 The impact of ultrasonic time on the mean droplet diameter and PDI of nanoemulsion

2.2.3 姜酮酚质量分数 本试验将0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%的姜酮酚加入到菜籽油中，试验结果如图6 所示，在姜酮酚添加量为0.1%时，吐温85 和卵磷脂制备的乳液粒径分别达到了粒径为（150.3±0.78）nm 和（253.7±1.1）nm，PDI 为0.158±0.008 和0.396±0.016，结果表明在相同的超声条件下，姜酮酚质量分数对纳米粒径的影响不大，可能由于姜酮酚的添加量相对较小，尚未对油相性质产生影响，故不会显著影响乳液粒径的大小[37]。

图6 姜酮酚质量分数对纳米乳液平均粒径和PDI 的影响Fig. 6 The impact of 6-paradol mass fraction on the mean droplet diameter and PDI of nanoemulsion

2.3 正交优化试验

根据单因素实验的结果，选择超声时间、超声功率和乳化剂质量分数作为变量，设计三因素三水平的正交试验对制备条件进行优化。从表中可知，表明各因素对粒径大小影响的显著程度为：超声时间>超声功率>姜酮酚质量分数，使用吐温85制备乳液的最佳条件是：1% Tween 85、超声功率250 W、超声时间15 min、姜酮酚质量分数为0.1%；使用卵磷脂制备乳液的最佳条件是1%卵磷脂、超声功率350 W、超声时间15 min、姜酮酚质量分数为0.2%。

2.4 纳米乳液的基本性质

使用吐温85 和卵磷脂制备的乳液，利用纳米粒度仪对稀释后的纳米乳液经过反复测量可知两种乳液粒径分别为（144.1±3.76）nm 和（241.4±2.12）nm，姜酮酚的包封率分别为（96.5±2.51）%和（87.47±1.84）%，可以较好地将姜酮酚地包封在其中，仅有少量渗漏至水相之中。

2.5 微观结构观察

利用尼罗红对乳液中的油脂进行染色，在图中显示为红色的液滴，并通过激光共聚焦显微镜对乳液的结构进行观察，结果如图7 所示。结果显示，原液中的液滴颗粒直径小，分布均匀，且与粒度分布结果基本一致[36]。

图7 吐温85（a）和卵磷脂（b）制备乳液的激光共聚焦（CLSM）图像Fig. 7 Laser confocal microscopy（CLSM）images of emulsions prepared from Tween 85（a）and lecithin（b）

2.6 纳米乳液离心稳定性和储藏稳定性

将姜酮酚纳米乳液采用5 000 r/min 分别离心5，10，15，20 min 观察相分离情况。结果如图8所示，在20 min 内，使用吐温85 制备的乳液离心后未产生分层、破乳现象，而卵磷脂制备的乳液在第5 分钟时就已经产生分层、破乳现象。因此，使用吐温85 制备的乳液比卵磷脂具有较好的离心稳定性。

图8 吐温85（a）和卵磷脂（b）的离心稳定性Fig. 8 Centrifugal stability of Tween 85（a）and lecithin（b）

纳米乳液通常在室温下储存，在4～8°C 下稍微冷藏有助于防止化学降解过程[34]。将新鲜制备的姜酮酚纳米乳液在25 ℃和4 ℃下储存1 个月，从表4 和图9 可以看出卵磷脂制备的乳液在4℃储存14 d 后由于乳液分层，粒径无法进行测定，而吐温85 制备的乳液粒径随储藏时间的增加粒径略有增加，表现了良好的稳定性。然而，两种乳液在25 ℃储藏都没有表现出很好的稳定性，液滴出现聚集，粒径变大，所以纳米乳液适合在低温（4 ℃）储存。

表4 不同乳化剂制备的乳液储藏1 个月的粒径变化（nm）Table 4 Particle size variation of emulsions prepared by different emulsifiers stored for one month（nm）

图9 储存稳定性Fig. 9 Storage stability

3 结论

本文使用超声处理，在粒径、PDI、包埋率、浊度、离心稳定性和储藏稳定性等方面对2 种乳化剂制备的乳液进行对比。研究表明，使用1%吐温85 制备的乳液各方面略优于卵磷脂，然而2 种乳液在25 ℃储藏都没有表现出很好的稳定性，液滴出现聚集，粒径变大，针对上述问题，后续研究可在如下方面进一步开展探索：完善乳液体系，选择天然乳化剂或者复配乳化剂；或使用高压均质进一步优化乳液制备条件，使其乳化效果更好，以此提高乳液稳定性。同时本研究为姜酮酚纳米乳液产品开发及其稳定性研究奠定基础，以及姜酮酚在食品加工领域中的应用提供了新思路。