柴归汤调控环磷酸腺苷/蛋白激酶B信号通路干预原发性高血压大鼠作用机制

许欣颖,胡小海,朱红俊

(1.南京中医药大学,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学无锡附属医院,江苏 无锡 214071)

高血压是冠状动脉疾病、心衰、脑卒中、外周血管疾病等心血管疾病的主要危险因素,每年有850万人因高血压死亡[1-3]。高血压的发病机制复杂,临床需联合使用多种单一机制的降压药物控制血压水平,存在局限性及不良反应,且难以治愈[4]。中医药治疗高血压具有巨大潜力,中药复方治疗疾病具有“多成分”“多通路”“多靶点”协同作用的优势,并已获得高质量临床证据[5-7]。本研究团队采用柴归汤(小柴胡汤与当归芍药散的合方)治疗1-2级高血压,取得一定临床疗效,且单用柴归汤治疗在降低舒张压幅度方面优于单纯西药治疗[8]。第二信使cAMP对心血管系统的血管舒张、心室收缩、心肌肥厚、细胞凋亡、细胞代谢等具有广泛调节作用[9]。cAMP信号通路是否参与以及如何参与柴归汤治疗高血压机制仍不清楚。本研究拟通过动物实验,探索柴归汤对cAMP/AKT信号通路的干预及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:从上海斯莱克实验动物有限公司[生产许可证编号 SCXK(沪) 2017-0005]购买野生型Wistar-Kyoto大鼠(SPF级)和原发性高血压(Spontaneously hypertensive,SH)大鼠。在江南大学医学院动物中心[实验动物使用许可证号SYXK(苏)2017-0052]随机分笼饲养,每笼5只。SPF级动物饲养屏障环境,环境湿度维持在50%,温度保持在25 ℃左右,进食饮水自由。采用灯光控制系统,每天50%光照与50%黑夜时间交替。

1.1.2 药物与试剂:柴归汤处方组成与剂量参照前期研究[10],柴胡、茯苓、生白术各60 g,北沙参、黄芩、生姜、当归、姜半夏各45 g,生白芍240 g,川芎、泽泻各120 g,柴归汤灌胃药剂由无锡市中医医院制剂室提供。柴归汤入肠代表性成分参照前期研究:柴胡皂苷A 0.15 mg/kg、毛蕊花糖苷5.09 mg/kg[11]。贝那普利(批号H20030514,规格10 mg/片)由无锡市中医医院药房提供。采用0.9%氯化钠溶液配制成0.2 mg/ml溶液。大鼠cAMP、AKT、PKA ELISA试剂盒(批号20210627)。

1.1.3 实验仪器:酶标仪(美国Bio Tek Instruments公司);无创血压测量系统(美国IITC Life Science公司);冷冻高速离心机(美国Thermo公司);PEX100磷酸化抗体芯片检测技术由上海华盈生物医药科技有限公司进行。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药:将购买的36只雄性原发性高血压大鼠4周龄预适应1周后(按照SPF级饲养标准适应性喂养)。Wistar-Kyoto (WKY)大鼠6只,体重175 ～ 225 g,雄性,12周龄,购自SPF(北京)生物技术有限公司,WKY大鼠为空白组,给予等体积0.9%氯化钠溶液。所有原发性高血压大鼠随机分为模型组、贝那普利组、柴归汤高剂量、中剂量、低剂量组,柴归汤入肠成分组,每组6只。贝那普利组剂量为6 mg/kg,柴归汤高剂量组15 g/kg、柴归汤中剂量组5 g/kg、柴归汤低剂量组3 g/kg,将所有生药的混合物在80 ℃的9倍热水中浸泡1 h,然后在96 ℃的水中提取两次(分别为4、2 h),喷雾干燥,制成干粉进行灌胃。柴归汤入肠成分组剂量为5.24 mg/kg。实验期间,大鼠自由获取食物和水。干预期间,各组大鼠每天灌胃1次,连续干预4周,每周检测1次血压并记录。

1.2.2 收缩压与舒张压检测:通过尾压法测量大鼠的收缩压和舒张压,使用啮齿动物无创血压测量系统。

1.2.3 ELISA检测血清cAMP、主动脉组织AKT、PKA水平:大鼠禁食过夜后,麻醉处死,取部分血样入普通试管,4 ℃下3000 r/min离心15 min分离血清。获得的血清样本保存在-80 ℃。快速收集部分主动脉组织,4%多聚甲醛固定48 h用于组织病理学分析,收集剩余主动脉组织,立即在-80 ℃冷冻。主动脉组织取匀浆,设置参数1500 r/min,运行20 s,间隔10 s,重复3次,于冷冻高速离心机离心20 min,12000 r/min,半径12 cm,取上清。检测全部在无锡市中医医院心血管疾病实验室进行,采用酶标仪测定。

1.2.4 PEX100磷酸化抗体芯片检测关键蛋白磷酸化:PEX100抗体芯片为信号通路广筛抗体芯片,芯片上固定有识别多条信号通路中关键蛋白的抗体,共1318种。该芯片上大部分抗体为配对抗体(584对),即每种磷酸化位点会有2种抗体共同检测,随机选择空白组、模型组和柴归汤高剂量组的部分大鼠心肌组织进行测定。使用Gene Pix Pro 6.0软件读取原始数据,样本内磷酸化水平计算:同一样本中,具有配对抗体的所有磷酸化位点蛋白,采用某位点磷酸化抗体信号值除以非磷酸化抗体信号值。组间磷酸化比值计算:在不同样本比较中,采用实验组某位点磷酸化水平除以对照组该位点磷酸化水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠收缩压、舒张压比较 见表1。与模型组相比,柴归汤低剂量、柴归汤中剂量、柴归汤高剂量组,柴归汤入肠成分组及贝那普利组均可显著降低原发性高血压大鼠第4周的收缩压和舒张压(P<0.01)。

表1 各组大鼠干预4周后收缩压及舒张压比较(mmHg)

2.2 各组大鼠血清cAMP及主动脉组织AKT、PKA表达比较 见表2。与空白组相比,柴归汤入肠成分组cAMP、柴归汤低剂量、中剂量组PKA、贝那普利组AKT均有所升高(P<0.05)。与模型组相比,柴归汤入肠成分组血清cAMP,柴归汤高剂量组、柴归汤中剂量组主动脉组织AKT,柴归汤中剂量组主动脉组织PKA水平均显著升高(P<0.05)。

表2 各组大鼠干预4周后血清cAMP及主动脉组织AKT、PKA比较

2.3 各组大鼠磷酸化抗体芯片检测结果比较 见表3、4(图1)。柴归汤将eNOS Ser1177磷酸化水平从模型组的2.8倍回调至1.5倍,柴归汤高剂量组AKT1 Thr450磷酸化修饰水平较模型组上调3.52倍,较空白组上调1.75倍。芯片上的每种抗体设置两次技术重复,以两次技术重复校正信号值作后续分析。

图1 各组大鼠AKT1 Thr450、eNOS Ser1177位点免疫荧光图

表3 各组大鼠干预4周后AKT1 Thr450、eNOS Ser1177位点校正信号值比较

表4 各组大鼠干预4周后AKT1 Thr450、eNOS Ser1177位点磷酸化比值比较

3 讨 论

高血压仍是全球心血管疾病死亡和残疾的主要原因。中医学认为,高血压归属于“头痛”“眩晕”范畴,其病机主要与“风、火、痰、虚、瘀”等有关,病位与肝、脾、肾三脏关系密切,病因与情志、饮食、劳逸失常等相关,病机多属本虚标实,虚实夹杂[12-13]。《素问·至真要大论篇》提出“诸风掉眩,皆属于肝”,黄莉等[14]总结当代名医经验,提出调整肝的阴阳平衡是中医治疗高血压的关键枢纽。团队基于龙砂医派和仝小林院士“三期六态”高血压诊治体系学术思想提出了高血压的新分型,其中体型正常或消瘦的高血压人群定义为厥阴型[15-16]。厥阴型高血压患者常多血少气,常有疲倦乏力、面黄无华、水肿貌等特征,脉象平弦或浮弦,为肝失疏泄,水液运输不利而致,针对厥阴型高血压,团队选用柴归汤治疗,柴归汤由小柴胡汤和当归芍药散合方而成,具有疏利气机,调畅肝气,活血利水之功[16-17]。日本汉方RCT循证医学报告提出《伤寒杂病论》经典方剂小柴胡汤、当归芍药散是治疗高血压等循环系统疾病的常用有效方剂[18]。柴归汤治疗高血压,已经取得较好的临床疗效[8]。团队通过UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法解析了柴归汤的功效成分;并进行动物实验深入研究,柴归汤能明显降低原发性高血压和高血压大鼠[19]的血压,参与调控原发性高血压的RAAS平衡及磷脂代谢[10-11]。本研究通过对原发性高血压大鼠cAMP信号通路检测,进一步探索cAMP信号通路对柴归汤干预高血压的作用机制。

目前认为,血管内皮通过释放各种生化因子来维持血管张力,调节下层血管平滑肌的收缩和松弛行为,调节炎症,免疫调节,血小板聚集和血栓形成,其机制与激活负责一氧化氮(NO)产生的内皮一氧化氮合酶 (eNOS)有关[20]。eNOS磷酸化是血管舒张的分子开关,缺乏eNOS基因的大鼠可表现出血压水平升高和内皮依赖性血管松弛功能丧失[21-22]。eNOS 磷酸化通过 PPAR-γ-eNOS、氧化应激、Rho途径、PI3K/Akt等信号途径调节NO[23]。NO通过介导血管舒张,降低血管阻力,从而降低血压,促进血管重塑[24]。

环状3',5'-腺苷单磷酸(cAMP)是许多器官中的主要第二信使,在工作心肌中,cAMP可以激活蛋白激酶A(PKA)以介导各种生物学效应,包括心脏重塑和肥大[25-26]。本实验研究结果示,柴归汤入肠成分组cAMP与模型组、空白组相比显著增加,柴归汤低剂量、中剂量组较模型组明显升高主动脉组织中PKA水平。cAMP/PKA/eNOS信号传导被证明可增强缺血部位的内皮祖细胞募集,诱导内皮分化,促进新生血管形成[27]。磷酸化抗体芯片检测结果显示,柴归汤将eNOS Ser1177磷酸化水平从正常的2.8倍回调到1.5倍。eNOS Ser1177的过度磷酸化可能是原发性高血压的代偿反应,报道指出eNOS从产生心脏保护性NO切换到产生细胞毒性超氧化物和二级活性氧,导致内皮功能严重丧失[28]。柴归汤通过调节eNOS Ser1177的过度磷酸化更有利于促进血管舒张而降低血压,并减少过氧化对血管内皮的危害。

本研究发现,柴归汤中剂量、高剂量组及贝那普利组均可显著升高大鼠主动脉组织AKT水平,PEX100磷酸化抗体芯片检测示AKT1 Thr450磷酸化修饰水平上调3.52倍。而AKT通过诱导eNOS丝氨酸1177位点(Ser1177)磷酸化,导致eNOS活性增加,实现对心脏的保护,cAMP/PI3K/AKT通路与PKA/eNOS通路可协同调节内皮血管生成[29-30]。例如西洛他唑通过cAMP/PKA和PI3K/AKT依赖性eNOS激活机制诱导NO产生,从而促使人主动脉内皮细胞中的血管生成[31]。有研究发现PKA与AKT可形成物理复合物,且AKT作为PKA的底物参与调节,免疫共沉淀结果示AKT和PKA与eNOS的存在相互作用关系[29,32]。与此同时,cAMP/PKA信号传导可以激活PI3K的p85α亚基并触发AKT激活,抑制内皮细胞凋亡,同时维持增殖,对血管损伤起到保护作用[33]。笔者推测柴归汤降压机制可能与cAMP/PKA,cAMP/PI3K/AKT协同激活eNOS调节血管内皮功能有关,但未测PI3K水平是一个遗憾,值得未来进一步设计实验研究。

综上所述,通过动物实验及磷酸化芯片抗体检测,柴归汤能够显著降低原发性高血压大鼠血压,其降压机制可能与cAMP/AKT、cAMP/PKA通路对eNOS的协同作用有关。