五苓散调控RAS 对阿霉素肾病综合征大鼠肾损伤的保护作用

何 丹，李 强，陈少丽，都广礼

（上海中医药大学基础医学院，上海 201203）

肾病综合征是一系列以大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症以及水肿为特征的肾脏疾病。该病并发症多［1］、复发率高［2］，且发病机制未明。因此，探讨肾病综合征的发病机制，寻找安全有效的治疗药物显得尤为重要［3］。

五苓散［4］出自《伤寒论》，由茯苓、猪苓、泽泻、白术、桂枝组成，是治疗阳不化气，水湿内停之经典方剂。近年来，五苓散的应用已不局限于蓄水证。研究表明，五苓散对改善泌尿系统［5-6］、心血管系统［7］疾病有明显优势。桂枝是樟科植物肉桂的干燥嫩枝，具有利尿、改善血液循环、扩张血管等多种药理活性［8］。徐灵胎在《医学源流论·古方加减论》中指出： “五苓之妙，专在桂枝”，可见桂枝在全方中起着至关重要的作用。桂皮醛是桂枝的主要化学成分，具有保护心肌［9］、调控血压［10］、减轻血管内皮损伤［11］等药理作用。课题组前期研究发现，桂枝是五苓散的“要药”，桂皮醛是桂枝的重要活性成分，并对阿霉素肾病大鼠肾功能有保护作用［12-13］。

本研究通过阿霉素构建肾病综合征大鼠模型，探讨五苓散及其拆方以及单体桂皮醛对肾病综合征模型大鼠的影响及其作用机制，以期为肾病综合征的临床治疗提供理论基础。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性SD 大鼠70 只，6～8 周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK （沪） 2020-0002。饲养环境为温度19～26 ℃，相对湿度30% ～70%，12 h/12 h 明暗交替，自由饮食饮水。本研究已通过上海中医药大学实验动物伦理委员会审查（伦理号PZSHUTCM190912007）。

1.2 药物 盐酸阿霉素（批号25316-40-9），购自上海沃凯化学试剂有限公司； 盐酸贝那普利（批号X2603），购自北京诺华制药有限公司。五苓散由猪苓9 g、茯苓9 g、泽泻15 g、白术9 g、桂枝6 g 组成，所有饮片均购自康桥中药饮片有限公司，经上海中医药大学都广礼教授鉴定为正品，所有饮片浸泡1 h，煎煮30 min，旋转蒸发浓缩，五苓散全方的给药质量浓度为1.6 g/mL，五苓散去桂枝方的给药质量浓度为1.4 g/mL，五苓散去桂枝加桂皮醛方的给药质量浓度为1.403 g/mL。桂皮醛对照品（批号104-55-2），购自上海源叶生物科技有限公司。所有药物以人临床剂量3 倍给药，并根据大鼠给药换算公式计算，剂量为10 mL/kg。

1.3 试剂 尿素氮 （批号2020001）、肌酐 （批号2020003） 检测试剂盒购自长春汇力生物技术有限公司； 尿蛋白检测试剂盒（批号C035-2-1） 购自南京建成生物工程研究所有限公司； ACE （批号sc-23908）、ACE2 （批号sc-390851）、Ang-2 （批号sc-74402） 一抗，购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司； GAPDH （批号60004-1-1g），购自美国Proteintech 公司； 山羊抗小鼠IgM 二抗 （批号L3032），购自美国Signalway Antibody 公司。

1.4 仪器 2-16PK 离心机购自美国Sigma-Aldrich 公司；Primo-Star 光学显微镜购自蔡司光学仪器（上海） 国际贸易有限公司； TS-8 摇床购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司； Epoch 酶标检测仪购自美国BioTek 公司。

2 方法

2.1 造模、分组及干预 70 只SD 大鼠按体质量随机分组，取正常组10 只，其余大鼠分别于实验第1 天和第8 天尾静脉注射阿霉素3 mg/kg 构建SD 大鼠阿霉素肾病综合征模型。造模成功后随机分为模型组、五苓散组、五苓散去桂枝组、五苓散去桂枝加桂皮醛组、桂皮醛组、贝那普利组，每组10 只，灌胃给予相应药物，具体灌胃剂量按每天体质量计算。其中，桂皮醛组给予26 mg/kg 桂皮醛溶液，贝那普利组给予12 mg/kg 贝那普利溶液。每天1 次，连续28 d。

2.2 检测指标 最后一次给药结束后收集大鼠24 h 尿液，腹主动脉取血于抗凝管，离心并收集血浆； 摘取肾脏，称定质量，左肾平均剖开，一半于甲醛中固定，另一半用OCT 包埋； 右肾分成3 份冷冻保存。

2.2.1 24 h 尿量及尿蛋白水平 代谢笼收集各组大鼠24 h尿液后测定具体尿量，3 000 r/min 离心5 min，取上清，按照相关试剂盒说明书检测尿蛋白水平。

2.2.2 肾功能指标 按照相关试剂盒说明书检测血浆中肌酐、尿素氮水平。

2.2.3 Western blot 法检测肾组织ACE、ACE2、Ang-2 蛋白表达 切取冷冻保存的肾脏组织，称定质量后放入1.5 mL 离心管，用剪刀将组织剪碎，加入裂解液，在冰上静置35 min，研磨，离心后取上清，用BCA 法进行蛋白定量。常规电泳、转膜，加入ACE、ACE2、Ang-2、GAPDH 一抗（1 ∶200） 37 ℃孵育1.5 h，洗膜后，室温加入山羊抗小鼠IgM 二抗37 ℃孵育45 min，洗膜，以GAPDH 为内参，用Image J 软件进行条带灰度值定量分析。

2.3 统计学分析 通过GraphPad Prism 8.0.1 软件进行处理，若为正态分布，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用TUKEY 法； 若不符合正态分布，用中位数及四分位数间距M（Q1，Q3） 进行统计描述，采用Kruskal-Wallis H 秩和检验，方差不齐时采用T2 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 五苓散对大鼠24 h 尿量、尿蛋白水平的影响 如图1所示，与正常组比较，模型组大鼠尿蛋白水平升高（P＜0.01），24 h 尿量减少（P＜0.01），表明阿霉素肾病综合征大鼠模型构建成功； 与模型组比较，五苓散去桂枝加桂皮醛组、桂皮醛组、贝那普利组大鼠尿蛋白水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 各组大鼠24 h 尿量、尿蛋白水平比较（±s，n＝3）

3.2 五苓散对大鼠肾功能的影响 如图2 所示，与正常组比较，模型组大鼠肌酐、尿素氮水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，五苓散去桂枝加桂皮醛组、桂皮醛组、贝那普利组大鼠肌酐、尿素氮水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图2 各组大鼠肌酐、尿素氮水平比较（±s，n＝3）

3.3 五苓散对大鼠肾组织ACE、ACE2、Ang-2 蛋白表达的影响 如图3 所示，与正常组比较，模型组大鼠ACE、Ang-2 蛋白表达升高（P＜0.01），ACE2 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，五苓散去桂枝加桂皮醛组、桂皮醛组、贝那普利组大鼠ACE、Ang-2 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），ACE2 蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 各组大鼠肾组织ACE、ACE2、Ang-2 蛋白表达比较（±s，n＝3）

4 讨论

肾病综合征在中医上被归为“水肿” “水气” 等范畴，其治疗原则主要应侧重于通阳利水［14］。五苓散是治疗阳不化气，水湿内停之经典方剂，常用于泌尿系统［5-6］、心血管系统［7］等疾病的治疗。桂枝是五苓散的“要药”，桂皮醛是桂枝的重要活性成分。

肾素血管紧张素系统（RAS） 的主要功能是调节和维持人体血压、水、电解质的平衡，是参与高血压发病的重要机制［15］。血管紧张素转换酶（ACE） 是RAS 的关键组成部分，肝脏释放的血管紧张素原被肾素水解为血管紧张素1（Ang-1） 后，可被ACE 裂解产生血管紧张素2 （Ang-2）［16］。而Ang-2 主要有血管收缩、水钠潴留、醛固酮释放等作用［17-21］。血管紧张素转化酶2 （ACE2） 是ACE 的同源物［22-23］，主要在肾脏血管内皮和肾小管上皮中表达［24］，能减少体内Ang-2 表达，从而具有内源性ACE 抑制剂的作用，进而降低血压，减轻肾损伤［25］。已有研究表明，阻断RAS对肾脏具有保护作用［26］。

肾病综合征可导致高血压的发生，而高血压又会进一步造成肾脏损害，两者相互作用，促使疾病不断发展［27-28］。蛋白尿是肾病综合征的主要表现，高血压的发生会加重蛋白尿［29］。研究表明，RAS 与血压、肾损伤和尿蛋白密切相关，可通过降低血压来减少肾损伤和蛋白尿［30］。其中，Ang-2 是参与疾病发展的主要因素［31］。

本实验采用阿霉素成功复制了肾病综合征大鼠模型。研究发现，五苓散去桂枝加桂皮醛、桂皮醛、贝那普利可降低阿霉素肾病综合征大鼠尿蛋白、肌酐、尿素氮含量，降低ACE、Ang-2 表达，同时使ACE2 表达升高。但五苓散组及五苓散去桂枝组未见尿蛋白、肌酐、尿素氮水平降低，ACE、Ang-2 表达降低及ACE2 表达升高。

综上所述，桂皮醛是五苓散发挥抗肾病综合征的主要活性成分，对阿霉素肾病综合征大鼠有一定的肾脏保护作用，其作用机制可能与RAS 信号通路有关。