巨细胞病毒抗原血症检测在肾移植术后的应用

白敏凤，胡伟，马寅锐，贾蔚，尹利民（.昆明市第一人民医院检验科，云南昆明 6504；.昆明市第一人民医院泌尿外科，云南 昆明 6504；.昆明市第一人民医院医院感染管理办公室，云南 昆明 6504）

肾移植是终末期肾病患者的最佳治疗选择，是改善终末期肾病患者的生活质量和生存率的有效方式。但免疫抑制及感染风险仍然是主要问题［1］。巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）是影响实体器官移植（solid organ transplantation，SOT）结局的最常见的机会性感染之一［2］，在不同的肾移植受者中，有40% ～ 100%的患者发生主动感染［3］。CMV与肾移植后肺炎、肝炎、视网膜炎及肾移植后急、慢性排斥反应的发生有着密切联系［2］。实验室检测巨细胞病毒的方法包括：分子测定、抗原血症检测、组织病理学、病毒培养和血清学检测等。病毒培养法检测巨细胞病毒具有高度特异性，但因灵敏度低和周转时间长应用逐渐减少。组织病理学是诊断巨细胞病毒感染的金标准，但由于是侵入性操作，除非在有严重组织受累时才需要完善该检查。目前临床上常规的CMV 检测多数都是检测血清中的IgG、IgM 抗体以及实时荧光定量PCR 的方法来检测巨细胞病毒的感染。但对于器官移植患者等人群，CMV 活动性感染或疾病的有效治疗以及采取先发制人的策略都需要早期、准确的诊断才能获得更好的结果。而移植后肾功能的评估，肌酐、他克莫司（tacrolimus，Tac/FK506）、淋巴细胞亚群具有重要的意义。因此，本研究对CMV 不同检测方法进行比较，通过检测肾移植患者的肌酐、FK506 药物浓度、淋巴细胞亚群等项目，评估CMV pp65 抗原血症检测在肾移植患者中的意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 一般资料：选取2021 年9 月至2021 年12 月昆明市第一人民医院就诊90 例肾移植患者的110 例血样。（其中20 例肾移植患者重复就诊），分别进 行CMV pp65 抗 原、CMV IgG、IgM 抗 体、CMV DNA、肌酐、淋巴细胞亚群、FK506 药物浓度等检测。

1.1.2 实验仪器：全自动化学发光免疫分析仪、荧光定量PCR 仪、液基薄层细胞制片机、全自动生化分析仪、BD 流式细胞仪等

1.1.3 实验试剂：CMV IgG 抗体检测试剂盒（化学发光法）、CMV IgM 抗体检测试剂盒（化学发光法）、HCMV 核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、他克莫司测定试剂盒（化学发光法）、肌酐测定试剂盒（氧化酶法）、BD Multitest IMK Kit。

1.2 实验方法

1.2.1 CMV pp65 抗原血症检测方法建立

1.2.1.1 外周血白细胞的分离：1 ml BD MultitestTMIMK Lysing Solution 加 入 待 测 标 本100 μl EDTA-K2抗凝全血混匀，离心、弃去上清液，取沉淀加1ml PBS 缓冲液，混匀后（12000 r×1 min）高速离心，计数白细胞数量，制成浓度为2×105/ml 外周血白细胞悬液。

1.2.1.2 细胞甩片机制片：取外周血白细胞悬液100 μl 制得外周血白细胞玻片。

1.2.1.3 免疫荧光染色：将PBS 1：1000 稀释后的抗HCMV pp65 单克隆抗体覆盖玻片，玻片置于37℃温箱孵育30 min（之后的步骤尽量不要让玻片干掉），冲洗浸泡，PBS 1：500 稀释后的FITC 标记羊抗鼠IgG 抗体覆盖玻片，避光37℃温箱孵育30 min，同样冲洗浸泡5 min，洗掉未结合物质。封片，避光保存。

1.2.1.4 荧光显微镜观察：阳性细胞核及细胞质荧光标记，呈黄绿色，镜下阳性细胞≥1 个，则认为该样本CMV 抗原血症阳性。

1.2.2 CMV IgG、IgM 抗体检测：待测样本分离胶管新鲜血清在MAGLUMI X8 全自动化学发光免疫分析仪检测。

1.2.3 CMV DNA 检测 EDTA-K2 抗凝全血1 ml，按照CMV DNA 检测的标准化操作流程进行检测。

1.2.4 一般项目检测：肌酐、淋巴细胞亚群、FK506 药物浓度均按照标准化流程留取标本并进行检测。

1.3 统计学处理：采用SPSS 21.0 对数据资料进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示。采用t 检验比较两组间差异。不符合正态分布的数据采用Box-Cox 转换成正态分布进行统计分析。计数资料率的组间比较采用卡方检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CMV pp65 抗原血症结果与CMV DNA 一致性比较：在对昆明市第一人民医院90 例肾移植受体的110 例血液样本的检测，CMV pp65 与CMV DNA同时阴性有45 例，同时阳性有27 例，一致性为65.5%（表1）。经Fisher 精确检验，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。

2.2 CMV pp65 抗原血症结果与CMV IgG 抗体一致性比较：在对110 例标本的CMV pp65 与IgG 抗体结果的比较中，CMV pp65 与IgG 抗体同时阴性1 例，同时阳性有62 例，一致性为57.3%（表2）。经Fisher 精确检验，差异不具有统计学意义（P ＞0.05）。

表2 CMV pp65 结果与CMV IgG 抗体定性结果比较

2.3 CMV pp65 抗原血症结果与血清肌酐比较：纳入样本110 例，数据不服从正态分布，采用BOXCOX 变换数据，如表3 所示，CMV pp65 抗原血症阴性46 例，肌酐平均值为（1.149±0.006）μmol/L，CMV pp65 抗原血症阳性64 例，肌酐平均值为（1.150±0.006）μmol/L，CMV pp65 抗原血症与肌酐差异无统计学意义（t ＝-0.729，P ＝0.468）。

表3 CMV pp65 抗原血症结果与肌酐的比较

2.4 CMV pp65 抗原血症结果与FK506 药物浓度比较（表4）：纳入样本96 例，数据服从正态分布，采用t 检验统计分析。CMV pp65 抗原血症阴性39 例，FK506 药物浓度平均值为（6.25±2.22）ng/ml，CMV pp65 抗原血症阳性57 例，FK506 药物浓度平均值为（6.63±2.47）ng/ml，CMV pp65 抗原血症与FK506 药物浓度差异无统计学意义（t ＝-0.768，P ＝0.445）。

表4 CMV pp65 抗原血症与FK506 药物浓度的比较

2.5 CMV pp65 抗原血症结果与淋巴细胞亚群比较：纳入样本43 例，CMV pp65 抗原血症阳性24 例，阴性19 例。CD8+T 细胞比例（CD3+CD8+/CD45+）、CD4+T 细胞比例（CD3+CD4+/CD45+）数据符合正态分布，采用t 检验进行统计分析；T 细胞比例（CD3+/CD45+）、NK 细 胞 比 例（CD16+CD56+/CD45+）、B 细胞 比 例（CD19+/CD45+）、CD4+T 细 胞/CD8+T 细 胞（Th/Ts）、CD3+总T 细 胞 绝 对 值、CD8+T 细 胞（Ts/Tc）绝 对 值、CD4+T 细 胞（Th/Ti）绝 对 值、CD4+CD8+双阳性T 细胞绝对值、NK 细胞绝对值、B 细胞绝对值不符合正态分布，采用Box-Cox 将非正态分布数据转换为正态分布。CMV pp65 抗原血症结果与T 细胞比例（CD3+/CD45+）、CD8+T 细胞比例（CD3+CD8+/CD45+）、CD4+T 细胞比例（CD3+CD4+/CD45+）、NK 细胞比例（CD16+CD56+/CD45+）、B 细胞比例（CD19+/CD45+）、CD4+T 细 胞/CD8+T 细 胞（Th/Ts）、CD3+总T 细胞绝对值、CD8+T 细胞（Ts/Tc）绝对值、CD4+T 细胞（Th/Ti）绝对值、CD4+CD8+双阳性T 细胞绝对值、B 细胞绝对值差异无统计学意义（P ＞0.05）。CMV pp65 抗原血症结果与NK 细胞绝对值差异有统计学意义（P ＜0.05）。如表5所示。

表5 CMV pp65 抗原血症与淋巴细胞亚群的比较（±s）

表5 CMV pp65 抗原血症与淋巴细胞亚群的比较（±s）

Box-Cox 转换前 Box-Cox 转换后淋巴细胞亚群t P阴性 阳性 阴性 阳性T 细胞比例（CD3+/CD45+）56.50±24.22 67.24±21.11 751.13±364.59 760.00±386.51 -0.077 0.939 CD8+T 细胞比例（CD3+CD8+/CD45+）CD4+T 细胞比例（CD3+CD4+/CD45+）NK 细胞比例（CD16+CD56+/CD45+）B 细胞比例（CD19+/CD45+）CD4+T 细胞/CD8+T 细胞（Th/Ts）31.00±12.57 35.24±14.65 31.00±12.57 35.24±14.65 0.596 0.554 23.32±14.49 29.67±14.73 23.32±14.49 29.67±14.73 -0.639 0.527 18.14±13.41 13.10±6.99 5.52±2.49 4.22±1.97 1.912 0.063 24.18±27.29 18.24±19.68 1.96±0.80 2.28±0.66 -1.456 0.153 0.75±0.41 0.94±0.59 -0.37±0.55 -0.17±0.56 -1.191 0.241 CD3+总T 细胞绝对值 1.00±0.91 0.87±0.77 -0.10±1.01 -0.54±0.89 1.524 0.135 CD8+T 细胞（Ts/Tc）绝对值0.51±0.48 0.40±0.30 -0.64±0.73 -1.02±0.57 1.905 0.064 CD4+T 细胞（Th/Ti）绝对值CD4+CD8+双阳性T 细胞绝对值0.43±0.45 0.43±0.49 -0.99±0.99 -1.25±0.92 0.887 0.380 0.01±0.02 0.01±0.01 -6.63±2.23 -7.21±1.61 0.973 0.337 NK 细胞绝对值 0.29±0.31 0.15±0.14 -1.24±0.75 -1.73±0.67 2.247 0.030 B 细胞绝对值 0.18±0.14 0.15±0.11 -1.77±0.70 -1.80±0.55 0.161 0.873

3 讨 论

CMV 是影响SOT 预后的一个重要的病原微生物，在肾移植术后不仅常见，而且严重影响肾移植的发病率和病死率［4-6］。CMV 复制存在于组织、血液或其他体液中，与症状无关，可通过核酸检测（NAT）、抗原检测和病毒培养法来检测 CMV 的复制。根据所使用的方法，血液中的 CMV 复制可以称为CMV DNA 血症 、CMV 抗原血症和CMV 病毒血症［7-8］。CMV DNA 检测是目前首选的诊断CMV感染的方法，被广泛地用于临床中诊断 CMV 疾病，确定何时开始先发性抗病毒治疗（PET）以及监测感染和/或疾病进程［9-10］，但该方法在区分潜伏性或活动CMV 感染方面具有一定局限 性。 而CMV pp65 抗 原 血 症 通 过 检 测CMV pp65 抗 原 来 诊 断CMV 感 染。pp65 抗 原 在CMV DNA 复制前就有合成，在出现临床症状前2 ～ 10 d 内可明显增高，CMV pp65 抗原阳性提示体内活动性巨细胞病毒复制完成，是HCMV 活动性感染的早期标志性产物［11］。肾移植患者对活动性感染或疾病的有效治疗以及采取先发制人的策略都需要准确、早期的诊断才能获得更好的结果，因此需要快速且准确的诊断方法［6］。目前对肾移植进行移植后监测的策略包括连续测量血清肌酐水平、临床随访以及肾脏活检等［12］。肌酐是目前常用的评估SOT后患者肾功能的常用指标。肾移植术后患者常规服用免疫抑制剂包括环孢素A、他克莫司等，通过调整免疫抑制剂的剂量来保持患者的免疫系统平衡。因此，在移植后监测患者的血药浓度、健康状况，以确保不会发生这些并发症［1］。采用流式细胞术对淋巴细胞亚群测定，T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、辅助/诱导性T 淋巴细胞及抑制/细胞毒性T 淋巴细胞的百分比或绝对计数可用于表征和监测某些形式的免疫缺陷及自身免疫疾病。

由于CMV 对临床预后的负面影响，肾移植后的预防是非常重要的治疗措施。对于肾移植术后CMV 感染预防有两大基本策略：抗病毒预防性治疗和抢先治疗。为了确保抢先治疗的有效性，需要对移植患者进行定期（每周1 次）的CMV pp65 抗原等实验室检测，得到CMV 感染的早期证据从而获得更好的长期生存率。因此，如何早期灵敏快速诊断CMV 感染对肾移植患者意义重大。本研究将自建的CMV pp65 抗原血症检测方法与CMV DNA 等方法进行比较，将CMV pp65 抗原血症的检测与CMV DNA 检测结合，对临床及时准确诊断CMV 感染具有一定意义。

3.1 CMV pp65 抗原血症检测与CMV IgG 抗体、IgM抗体及CMV DNA 结果讨论：本研究对110 例肾移植后样本进行CMV pp65 抗原血症检测的同时，对CMV IgG 抗体、IgM 抗体及CMV DNA 也进行检测。

血清学检测CMV IgG 抗体及IgM 抗体是用来证明CMV 感染最常用的方法。本实验用化学发光定量检测肾移植后110 例样本的CMV IgG 抗体、IgM抗体，110 例样本的IgM 抗体结果均为阴性，CMV IgM 抗体最初是在早期CMV 感染过程中分泌的，若通过血清学检测法检测到CMV IgM 抗体则表明是活跃，急性或近期感染，但由于肾移植病人应用免疫抑制剂，影响IgM 抗体检测结果，IgM 抗体阳性率低，不适合做早期诊断的指标，本实验IgM 抗体则不纳入讨论。两种方法与IgG 抗体比较，CMV pp65与IgG 抗体同时阳性有62 例，同时阴性有1 例。CMV IgG、IgM 血清学检测在诊断肾移植术后CMV病方面的作用有限，移植受者由于接受免疫抑制治疗，CMV 感染后产生抗体的时效性和能力都会受到限制［13］。

CMV DNA 检测是目前主要用于CMV 感染的检测方法，通过实时荧光定量PCR 的方法定量分析CMV DNA 的表达情况，从而判断巨细胞病毒感染的状况。由于其高灵敏度和高通量，已成为首选的诊断测试方法。因此，它被广泛地用于临床诊断 CMV 疾病，确定何时开始先发性抗病毒治疗以及监测CMV 感染和/或疾病进程［10-11］。在本研究对CMV pp65 抗原血症与CMV DNA 结果比较，CMV pp65 抗原血症检测结果与CMV DNA 同时阴性有45 例，同时阳性有27 例。CMV pp65 抗原阳性、DNA 阴性的样本，可能是由于CMV pp65抗原出现时间较DNA 出现早，DNA 未能及时检出，也可能由于CMV DNA 检测灵敏度不够。CMV pp65 抗原阴性、DNA 阳性的样本，可能是由于抗原血症的检测对白细胞数量有一定要求，而在显微镜下观察有无阳性细胞存在操作者主观因素的影响。

在研究过程中，其中1 例肾移植术后患者发热原因不明，临床排除细菌及真菌感染，多次全血CMV DNA 结果均为阴性，而该患者CMV pp65 抗原血症阳性，提示CMV 感染导致的发热不除外。经二代测序验证，该患者检出CMV 感染。予以抗病毒治疗，临床症状好转。该案例反映CMV pp65 抗原血症检测能够早期发现CMV 复制，对CMV 感染的早期诊断有较大价值。该案例也反映出目前全血CMV DNA 检测可能存在灵敏度不足的问题。因此，将CMV pp65 抗原血症的检测与CMV DNA 检测结合，对临床及时准确诊断CMV 感染具有一定意义。

3.2 CMV pp65 抗原血症检测与肌酐、FK506 药物浓度及淋巴细胞亚群等之间的相关性：CMV 感染与急性排斥反应和慢性同种异体移植损伤相关，包括在肾移植后患者中的慢性同种异体肾病［2，13］，肌酐、FK506 药物浓度及淋巴细胞亚群是评估移植肾损伤的几个有效指标。在本研究中，CMV pp65抗原血症检测结果与肌酐、FK506 药物浓度差异不具有统计学意义，CMV pp65 抗原血症在反映CMV 感染方面意义尚不明确。但不排除实验操作直接影响统计结果：样本数量收集不足导致统计结果有差异，患者是否能够遵医嘱服药、免疫抑制状态下是否有其他病毒及细菌感染、患者移植术后的时间以及是否发生移植排斥反应等外源性因素都会干扰肌酐、FK506 结果从而直接影响统计结果。

细胞免疫的测定即对淋巴细胞亚群的数量和/或功能进行检测，已成为一种临床工具，可帮助SOT 后CMV 风险分层和管理［2，14］。在本研究中， CMV pp65 抗原血症结果与NK 细胞绝对值差异具有统计学意义（P ＜0.05），CMV pp65 抗原血症阳性的样本NK 细胞绝对值均低于pp65 阴性的样本。NK 细胞绝对值一定程度上可以用来评估CMV感染。

4 结 论

CMV pp65 抗原血症检测与CMV IgG 抗体结果比较不具有统计学意义。CMV pp65 抗原与CMV DNA 结果一致性为65.5%，两种方法联合检测，对提高CMV 感染临床诊断准确率具有一定意义。

在CMV pp65 抗原阴性组与阳性组中，血清肌酐水平、全血FK506 药物浓度两组间差异无统计学意义。

在CMV pp65 抗原阴性组与阳性组中，NK 细胞绝对值差异具有统计学意义，NK 细胞绝对值偏高的肾移植患者，发生CMV 感染的概率偏低。