HPLC法同时检测清肺排毒汤中7种有效成分的含量

张 莹，刘 冰，郭 华，张博雄，吴世涛

（襄阳职业技术学院 医学院，湖北 襄阳 441050）

新型冠状病毒感染（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）患者以发热、干咳、乏力为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状，属于中医疫病范畴［1-2］。从《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（第三版）》开始，清肺排毒汤就成为中医治疗的临床推荐用药，直至2023年最新的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（第十版）》，清肺排毒汤仍然是中医治疗的临床推荐首选用药，适用于轻型、中型、重型和危重型病例，其有效性和安全性得到了进一步的证实［3-4］。清肺排毒汤是《伤寒论》和《金匮要略》经方的创新和发展，由麻杏石甘汤、五苓散、小柴胡汤、射干麻黄汤四首经方组成，以麻杏石甘汤为君方，以五苓散和小柴胡汤为臣方，以射干麻黄汤为佐使方，辛温辛凉并用，甘淡芳香，多法齐下，共同针对寒热湿毒等诸实邪，同时又兼顾体质之虚证［5-6］。清肺排毒汤由麻黄、炙甘草、杏仁、生石膏、桂枝、泽泻、猪苓、白术、茯苓、柴胡、黄芩、姜半夏、生姜、紫菀、款冬花、射干、细辛、山药、枳实、陈皮和藿香21味药组成，在临床应用中主要以中药汤剂和中成药清肺排毒颗粒（2021年3月上市）为主。由于清肺排毒汤的主方药味较多，化学成分较为复杂，目前对其质量控制的研究较少［7-12］，中成药清肺排毒颗粒也尚无质量标准，特别是具有良好临床效果的清肺排毒汤的质量控制显得尤为重要。本文对清肺排毒汤中主要7种有效化学成分即盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、黄芩苷和黄芩素的质量控制进行研究，建立了HPLC法同时测定清肺排毒汤中7种有效成分的含量，为清肺排毒汤以及清肺排毒颗粒质量控制的建立奠定了基础。

一、仪器与材料

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；BSA224S电子天平（德国赛多利斯集团）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；中药自动煎煮壶（九阳股份有限公司）。

中药饮片：麻黄、炙甘草、杏仁、生石膏、桂枝、泽泻、猪苓、白术、茯苓、柴胡、黄芩、姜半夏、生姜、紫菀、款冬花、射干、细辛、山药、枳实、陈皮和藿香均购于当地中药房（襄阳普天独活大药房）。

对照品：盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱购于中国食品药品检定研究院；苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、黄芩苷和黄芩素均购于成都瑞芬思生物科技有限公司，以上对照品含量均大于98%。

试剂：甲醇和乙腈为色谱纯，水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），其他试剂纯度均为分析纯。

二、方法与结果

（一）溶液配制

1.供试品溶液的配制。按照清肺排毒汤药方取中药饮片：麻黄9 g，炙甘草6 g，杏仁9 g，生石膏（先煎）30 g，桂枝9 g，泽泻9 g，猪苓9 g，白术9 g，茯苓15 g，柴胡16 g，黄芩6 g，姜半夏9 g，生姜9 g，紫菀9 g，款冬花9 g，射干9 g，细辛6 g，山药12 g，枳实6 g，陈皮6 g和藿香9 g。向生石膏中加入240 mL纯水先煎15 min，将其他饮片加8倍纯水量浸泡30 min，放进煎好的生石膏水中先武火煎煮，再转文火煎煮30 min，煮好后倒出药液，进行二次煎煮。二次煎煮加入6倍纯水量先武火煎煮，再转文火煎煮30 min。合并两次药液过滤，将药液减压浓缩至400 mL，得到清肺排毒汤供试品溶液，0.22µm微孔滤膜过滤待用。

2.对照品溶液的配制。单独对照品溶液：分别取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、甘草苷、苦杏仁苷、甘草酸、黄芩苷和黄芩素对照品适量，用甲醇溶液定容至刻度，0.22µm微孔滤膜过滤，作为单独对照品溶液待用。

混合对照品溶液：精密吸取上述各单独对照品溶液各1 mL，用甲醇定容至10 mL，0.22µm微孔滤膜过滤，作为清肺排毒汤混合对照品溶液待用。

（二）色谱条件

色谱柱：Venusil MP-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5µm，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：210 nm；流动相：A：0.1%磷酸，B：乙腈，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

（三）多指标成分含量测定的方法学考察

1.专属性试验。分别取各成分单独对照品溶液和混合对照品溶液以及清肺排毒汤供试品溶液，按照前述色谱条件进样测试，记录保留时间和色谱峰。清肺排毒汤样品溶液（a）和混合对照品溶液（b）的HPLC色谱图见图1。由图可见，各对照品的色谱峰分离度较好，且供试品溶液无干扰，表明该方法的专属性良好。

图1 清肺排毒汤样品溶液（a）和混合对照品溶液（b）的HPLC色谱图

2.线性考察。精密取已制备的混合对照品溶液适量，用甲醇稀释定容得到不同浓度的混合对照品溶液，按照前述色谱条件进样，记录峰面积，以对照品浓度为横坐标（x），以色谱峰面积为纵坐标（y），分别绘制各对照品的标准曲线，得到线性回归方程。线性回归方程、相关系数及浓度范围见表2。结果表明，各对照品在各自的浓度范围内，浓度与峰面积的线性关系良好。

表2 线性关系考察

3.仪器精密度试验。取已制备的混合对照品溶液，按照前述色谱条件重复进样6次，记录各对照品的色谱峰面积，计算其峰面积的相对标准偏差（RSD）值（n=6）。盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、甘草苷、苦杏仁苷、甘草酸、黄芩苷和黄芩素峰面积的RSD值分别为1.14%、1.02%、0.98%、1.05%、1.25%、0.89%和0.97%。结果表明，仪器精密度良好。

4.重复性试验。取已制备的清肺排毒汤药液平行样本6份，按照前述色谱条件进样，记录各成分的色谱峰面积，根据峰面积计算其含量的相对标准偏差RSD值（n=6）。计算得到盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、甘草苷、苦杏仁苷、甘草酸、黄芩苷和黄芩素含量的RSD值分别为1.02%、1.23%、1.32%、0.88%、1.09%、0.97%和0.96%。结果表明，该方法的重复性良好。

5.回收率试验。精密量取己制备的清肺排毒汤药液10 mL，共36份，每9份为一组，每组按照各成分含量的80%、100%、120%分别加入低、中、高3个水平的各成分单独对照品溶液，每个水平3个平行样。按照前述色谱条件进样，记录峰面积，计算各成分的含量。各成分的加标回收率结果见表3。盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、甘草苷、苦杏仁苷、甘草酸、黄芩苷和黄芩素的平均加标回收率和RSD值分别为102.64%/1.13%、101.41%/1.54%、102.66%/0.98%、101.41%/0.63%、100.07%/1.88%、102.17%/0.75%和99.21%/1.22%。结果表明，该方法的加标回收率良好。

表3 清肺排毒汤中7种成分的加标回收率（n=9）

6.稳定性试验。取已制备的同一批清肺排毒汤药液，于室温下放置，按照前述色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测试，记录各成分的色谱峰面积，计算各成分的RSD值。计算得到盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、甘草苷、苦杏仁苷、甘草酸、黄芩苷和黄芩素含量的RSD值分别为1.32%、1.21%、0.99%、0.78%、1.02%、0.97%和1.02%。结果表明，该供试品7种成分在24 h内室温放置稳定。

7.样品含量测定。取已制备的清肺排毒汤药液，按照前述色谱条件进样，记录各成分的色谱峰面积，按照前述线性考察项下的标准曲线，采用外标法计算药液中各成分的含量，重复3次得到平均值。测得清肺排毒汤药液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、甘草苷、苦杏仁苷、甘草酸、黄芩苷和黄芩素的含量分别为180.67 µg·mL-1、90.32 µg·mL-1、61.26 µg·mL-1、324.62 µg·mL-1、126.36 µg·mL-1、1608.86µg·mL-1和62.12µg·mL-1。

三、讨论

为保证清肺排毒汤的质量，本试验按照经方《清肺排毒汤》采用水煎法进行供试品的制备，其中生石膏进行先煎，采用二次煎煮法，通过减压浓缩使供试品浓度达到最佳测量范围。

由于甲醇在HPLC检测中存在紫外末端吸收，试验中采用乙腈作为流动相B，流动相A选用了纯水、0.1%磷酸、0.1%甲酸、0.1%冰醋酸、0.1%三氟乙酸流动相体系进行对比考察。结果显示，以0.1%磷酸-乙腈作为流动相时，基线平稳，清肺排毒汤供试品溶液中7种有效成分色谱峰峰型较好，与相邻色谱峰分离效果最佳，通过对流动相比例的不断优化，最终采用表1中A：0.1%磷酸，B：乙腈的梯度洗脱比例对清肺排毒汤中7种成分含量同时进行测定。

采用PDA检测器在190～400 nm范围对盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、甘草苷、苦杏仁苷、甘草酸、黄芩苷和黄芩素进行紫外吸收光谱扫描，结果显示，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、甘草苷、苦杏仁苷、甘草酸、黄芩苷和黄芩素7种化学成分的最大吸收波长分别为257、207、276、215、249、278、277 nm，最终选择210 nm作为检测波长。

四、结论

清肺排毒汤共由21味中药组成，处方涵盖面广，苦温辛寒并用，芳香甘淡共施，润燥化饮兼顾，在临床治疗新型冠状病毒感染中效果显著。但由于其主方药味较多，所含化学成分复杂多样，导致其质量控制复杂繁琐。本研究首次建立了HPLC法同时测定清肺排毒汤中7种成分的含量，采用Venusil MP-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5µm），柱温为25 ℃，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为210 nm，流动相：A：0.1%磷酸，B：乙腈，梯度洗脱。方法学验证表明该方法重复性和稳定性较好，在各成分浓度范围内线性关系良好，平均回收率99.21%～102.66%，RSD0.63%～1.88%（n=9）。通过外标法，计算得到清肺排毒汤药液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、甘草苷、苦杏仁苷、甘草酸、黄芩苷和黄芩素的含量。该方法简便可靠、准确快速、结果可靠，为清肺排毒汤质量控制提供科学依据。