黄曲霉毒素B1诱导大鼠肝细胞凋亡率剂量效应模型的构建

黄奥迪，严佳惠，张昭寰,2，刘海泉,2,3，赵 勇,2,3，欧 杰,2,3,*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海 201306）

黄曲霉毒素是一类由黄曲霉和寄生曲霉等菌株产生的高毒性次级代谢物的总称[1]，广泛存在于谷物、蔬菜、肉类等食物中，严重危害食品安全[2]。其中，黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是黄曲霉毒素中出现频率最高且毒性和致癌性最强的[3]，AFB1主要毒性作用的靶器官是肝脏[4]。Mughal等[5]研究已经证实AFB1通过引起肝细胞凋亡和干扰细胞酶活性引起肝功能障碍，作用机制涉及肿瘤抑制基因形成DNA加合物，从而导致基因突变，对人类造成致癌性，影响人体健康。

剂量效应模型（dose-response model，DRM）是食品风险评估框架中危害特征描述的重要组成部分，其本质在于定量描述暴露于危害物的剂量与发生不良反应概率之间的关系[6]。目前国内外已开展的DRM研究包括沙门氏菌[7]、副溶血性弧菌[8]、蜡样芽孢杆菌[9]等，但是国内关于真菌毒素构建DRM的研究较少，且聚焦于AFB1构建DRM也缺乏系统性的研究[10]。AFB1生物性危害主要通过产生相应的毒素或者宿主进食具有感染性的病原体从而影响人体健康，在我国肝癌的高发地区广西由于人们经常食用含有AFB1的食物，导致肝脏负担增加，从而引发肝脏疾病。产生黄曲霉毒素的真菌大多存在于气候炎热潮湿的地区，由于收获前和收获后的真菌污染，在食物中发现了黄曲霉毒素，黄曲霉毒素对食物的污染速度和程度取决于温度、湿度、土壤和储存条件[11]。AFB1慢性毒性不仅会使体质量减轻、肝脏相关指标上升，还会增加肾脏的压力，造成尿酸浓度升高；而AFB1急性毒性会诱发肝脏损伤、肾衰竭、肝细胞坏死，甚至引起死亡[12]。欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）前期已经按照国家和年龄分组开展了黄曲霉毒素的暴露评估，并进行了定性的风险评估分析[13]，在此基础上进行AFB1的DRM研究可为其风险评估提供定量依据。

接触0.36 mg/kgmb及以上的AFB1会导致动物和人类急性肝损伤和死亡。已有研究报道有关AFB1导致肝细胞凋亡的定性研究，但关于AFB1急性暴露于肝脏的定量数据和有关剂量效应模型的研究很少。因此，本研究以大鼠为研究对象，通过设计实验研究不同剂量AFB1对大鼠肝细胞凋亡率的影响，并基于实验数据应用指数模型、对数模型、Weibull模型、Hill模型等常用模型拟合可能的剂量效应关系，通过数学检验进行参数比较，选择最优的DRM为黄曲霉毒素风险评估提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

48 只SPF级雄性Wister大鼠，体质量180～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养于环境控制的动物实验室内，自由饮水饮食，饲养温度22～24 ℃，相对湿度50%～55%，光照条件：亮暗周期各12 h。本研究进行的动物实验程序均按照上海中医药大学《实验动物护理与使用指南》进行，并经中国动物中心动物伦理委员会和上海中医药大学批准，审查批准编号：PZSHUTCM210115014。

AFB1上海吉至科技有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）生工生物工程（上海）股份有限公司；水合氯醛 阿达玛斯试剂有限公司；多聚甲醛、无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司；TUNEL染色试剂盒 武汉塞维尔生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DW-88L338超低温保存箱 青岛海尔特种电器有限公司；恒温培养箱 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；HH-S11-2-S恒温水浴锅 上海新苗医疗器械制造有限公司；ZH5102A电子天平 珠恒电子有限公司；JB-L5冻台 武汉俊杰电子有限公司；RM2016病理切片机 上海徕卡仪器有限公司；KD-P组织摊片机浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；GFL-230烤箱天津市莱玻瑞仪器设备有限公司；G6004防脱载玻片、TSY-B脱色摇床、WG1066-1组化笔 武汉塞维尔生物科技有限公司；Giotto染色机 意大利DIAPATH公司；Eclipse E100正置光学显微镜 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 造模及分组

48 只大鼠经过1 周的适应性饲养后，随机分为4 组（每组12 只）。空白组（CK组）：腹腔注射与AFB1剂量组相同量的4% DMSO溶液；AFB1低剂量组（LD组）：腹腔注射剂量为1 mg/kgmb的AFB1工作液一次；中剂量组（MD组）：腹腔注射剂量为2 mg/kgmb的AFB1工作液一次；高剂量组（HD组）：腹腔注射剂量为3 mg/kgmb的AFB1工作液一次，AFB1溶于4% DMSO溶液。AFB1的剂量根据参考文献[14]和预实验结果初步确定。

1.3.2 实验动物处理

造模后的48 h对大鼠使用10%水合氯醛（350 mg/kgmb）进行麻醉处理，待麻醉之后对大鼠进行解剖，分离大鼠的肝脏组织并使用4%多聚甲醛溶液浸泡固定。

1.3.3 肝细胞凋亡率的测定（TUNEL染色）

在4%多聚甲醛中固定24 h后，取出肝脏组织进行石蜡包埋和切片（4 µm），然后对石蜡切片脱蜡复水，将蛋白酶K工作液滴加到组织切片处理，PBS漂洗，之后进行破膜处理和室温平衡，加入TUNEL反应混合液（TdT酶∶dUTP∶Buffer＝1∶5∶50（体积比））在37 ℃恒温箱中孵育2 h，PBS洗涤后滴加3%牛血清白蛋白覆盖组织，加入双抗，之后滴加DAPI染液，室温避光放置10 min，滴加抗荧光猝灭封片液后使用荧光显微镜观察拍照并进行细胞数量计算。肝细胞凋亡率按式（1）计算：

1.3.4 剂量效应模型构建

常见的DRM包括指数模型、对数模型、Weibull模型、Hill模型等。以下模型中d为大鼠的注射剂量（mg/kgmb），P为大鼠肝细胞凋亡率，A、B、C均表示常数（表1），应用Origin Pro for Windows 8.0软件中的Levenberg-Marquardt法（非线性最小二乘法）进行拟合。

表1 常见剂量效应模型及其相关参数Table 1 Common dose-response models and related parameters

1.3.5 数学检验与评价

参照Kasuya等[15]建模数学检验参数决定系数R2和Lin等[16]赤池信息量准则（Akaike information criterion，AIC）、贝叶斯信息准则（Bayesian information criterion，BIC）进行模型拟合度评价和最佳模型选择，相关表达式如下：

式中：SSE为方差分析的残差平方和；SST为总离差平方和。

式中：k为模型中未知参数个数；n为样本数量；L为模型中极大似然函数值。

其中AIC代表实际值与预测值之间的符合程度，理论上AIC越小越好，然而当模型的复杂度提高（参数个数k增大）时，似然函数值也会增大，从而导致AIC变小。当k过大时，似然函数值增速减缓，模型过于复杂造成过度拟合现象。针对该问题，BIC引入了与参数个数相关，与AIC相比更大的惩罚项，考虑了当参数个数变大时，模型精度提高所造成的模型复杂度过高的现象。

2 结果与分析

2.1 AFB1对大鼠肝细胞凋亡的影响

图1为TUNEL染色结果部分切片，蓝色部分代表正常肝细胞，其核膜结构完整；绿色部分代表凋亡肝细胞，其核膜结构呈现簇状或碎片状。由图1A～D可知，与CK组相比，LD组、MD组和HD组的凋亡率显著上升，且随着剂量的提高细胞凋亡率也有所上升（P＜0.05）。

图1 AFB1对大鼠肝细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of AFB1 on apoptosis in rat hepatocytes

2.2 大鼠肝细胞凋亡率剂量效应关系的拟合

根据大鼠腹腔注射AFB1诱导肝细胞凋亡的定量数据（图1），应用不同DRM拟合非线性关系如图2所示。由图2可知，除了在迭代次数范围内未收敛的Weibull模型1以外，其余DRM都达到了收敛的统计要求，并且相同的模型出现了几乎重合的现象。其中DRM所预测的半数有效量（median effective dose，ED50），即能引发50%细胞凋亡的剂量均为1.91 mg/kgmb左右，与实际实验所用剂量大致相当，也与EFSA[17]所预测的随着AFB1浓度提高，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发生概率显著升高的趋势相同。对于AFB1造成肝细胞凋亡率的ED50可通过动物模型毒理学实验进行进一步确认，本实验结果仅作为预测剂量效应关系使用。

图2 AFB1诱导大鼠肝细胞凋亡率不同剂量效应模型的拟合曲线Fig.2 Fitting curves of different dose-response models for AFB1-induced apoptosis rate in rat hepatocytes

从拟合结果来看，Weibull模型、Gamma模型和剂量效应曲线分别对应图2中的曲线G、H、K、L，其决定系数R2＞0.9960（表2），在拟合效果上优于其他模型。相同的模型在外延至高剂量和最小有效量时几乎重合，预测细胞凋亡率结果与Ruggeberg等[18]实验测得大鼠静脉注射AFB1肝细胞凋亡率结果相似，证明本实验DRM的可信性，但食品等残留AFB1导致肝细胞凋亡的相关数据需要深入实验。

表2 AFB1诱导大鼠肝细胞凋亡率剂量效应模型的参数估计及数学检验Table 2 Parameter estimation and mathematical testing of doseresponse models for AFB1-induced apoptosis rate in rat hepatocytes

2.3 剂量效应模型的数学检验

对构建的DRM进行数学检验（表2），对比参数决定系数R2和AIC可知，剂量效应曲线（R2＝0.9970）和指数模型2、3（AIC＝33.91）优于其他模型。

将BIC纳入考虑的范畴内，Gamma模型的BIC值（BIC＝17.19）仅比剂量效应曲线的BIC值（BIC＝15.88）大，且AIC值优于大多数模型，参数决定系数也处于上述考虑范围内。Gamma模型（R2＝0.9964，AIC＝37.40，BIC＝17.19）优于其他模型综上所述，Gamma模型可作为AFB1诱导大鼠肝细胞凋亡率最优的DRM用于剂量效应模型拟合的理论参考。

3 讨论

急性暴露于AFB1不仅会影响肝脏和肾脏等器官[19]，还会抑制人类的免疫系统，使其受到传染病的危害[20]。据报告，啮齿动物口服AFB1的半数致死量在1～18 mg/kgmb之间[21]，而其他物种的研究表明AFB1的剂量小于1 mg/kgmb也可能导致死亡[22]，证明AFB1不仅会对器官造成不可逆的影响，还会威胁生命健康。EFSA食品链污染物小组根据各项动物研究数据推断认为AFB1每日摄入量不得超过0.4 μg/kgmb，由于使用人类志愿者代替动物模型研究获得剂量效应数据的方法存在许多困难，关于AFB1的人类数据远不如动物数据那样丰富，因此一般采用换算系数的方法外推有关人类的数据[23]。

本研究选用大鼠Wister腹腔注射肝细胞凋亡率的实验数据建立DRM，由于AFB1检测报告大多属于定性检测，关于大鼠的定量数据较少，缺少一定的参考，因此可能存在些许误差。Williams[24]对虹鳟鱼进行的剂量效应研究为AFB1风险评估模型提供了支持，未来定量风险评估必然是风险评估的新趋势所在[25]。

指数模型是食品中有害物建立DRM的首要选择，如沙门氏菌[26]、诺如病毒[27]等微生物均对指数模型表现出了良好的拟合性。然而有关霉菌毒素的DRM很少有研究，Gilbert-Sandoval等[28]基于生理动力学建模的反向剂量法预测AFB1在大鼠和人中的急性肝毒性剂量反应数据，通过定量体外剂量评估AFB1急性肝毒性并预测体内毒性评估，为本实验预测AFB1对于肝细胞凋亡率趋势变化提供了参考。通过拟合模型推导低剂量效应存在不准确的可能性，会出现低剂量外推数据溢出问题[29]，因此在将本研究结果外推至人体或实际应用时应谨慎。

建立剂量效应模型后有必要采用志愿者实验进行验证，但是文献中关于人类吸收AFB1的数据仅有Jubert等[30]召集3 位男性志愿者口服低剂量（30 ng）数据，在暴露1 h后观测到血浆中的最大放射性尚未达到肝细胞凋亡的最低有效剂量，对于本研究不具备参考性。同时AFB1的感染剂量也会因为受体、环境因素、毒素作用等因素导致数据不同[31]，因此本研究采用常用的数学检验系数R2和AIC以及BIC评价和选择。通过比较，建议选用Gamma模型作为黄曲霉毒素导致肝细胞凋亡率最优剂量效应模型。

随着风险评估模型的发展，在建立剂量效应模型的时候可以引入其他信息，例如引入新的参数TPI（time post inoculation），用于预测时间和剂量同时作为自变量引起的反应变化，从而建立时间剂量效应模型评估反映随时间和剂量的发展趋势，同时也能结合宿主因素(如年龄、性别）或病原体因素(如微生物气溶胶直径、感染性）等[32]。本研究结论仅针对于模型方法论时证明其可行性较好，在外推应用时应谨慎使用[33]。

4 结论

本研究基于AFB1诱导大鼠肝细胞凋亡的定量分析结果，分别应用指数模型、对数模型、Weibull模型、Hill模型、Gamma模型、剂量效应曲线6 种模型拟合了AFB1诱导大鼠肝细胞凋亡率的剂量效应模型，其中指数模型、Gamma模型、剂量效应曲线表现出良好的拟合性，根据数学检验结果，建议选用Gamma模型作为AFB1诱导大鼠肝细胞凋亡率最优的剂量效应模型用于AFB1定量风险评估框架中的危害特征描述。