丰富环境训练结合头穴丛刺对孤独症谱系障碍模型大鼠行为的影响

穆姿辰， 唐强， 史云秋， 王艳， 朱淑伟， 庄亚楠， 徐丹双， 李宏玉， 李保龙,，张春艳,， 袁孟珂

1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨市 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨市 150001

0 引言

近年来，孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder, ASD)发病率在全球范围内呈上升趋势。美国疾病预防控制中心最新研究显示，美国8 岁儿童ASD 患病率已达到1/36[1]。

ASD 起病于婴幼儿时期，以社交沟通和社交互动障碍，行为、兴趣或活动模式重复、受限等异常行为为特征[2]，重复刻板行为和/或兴趣狭窄是其核心症状[3]。其病因和病理机制仍未明确，也尚未有疗效确切的治疗方法[4]。对ASD 患儿社交能力和异常行为的改善有助于其参与社会生活，提升生活质量。

目前ASD异常行为模式的干预方法多采用感知治疗、行为分析、音乐疗法等一种或多种疗法相结合的方式。丰富环境集触觉、视觉、听觉、运动和空间位置觉于一体，能够改善ASD大鼠的社交能力，减少刻板行为[5]。

针灸尤其是头穴丛刺一直被广泛用于脑血管疾病的治疗中[6]，近年来也逐渐被应用到抑郁、ASD 等疾病治疗中[7]。

有研究表明，ASD 患儿的社交能力和情绪变化与白细胞介素(interleukin, IL)-6、IL-1β密切相关[8]。

本研究观察丰富环境训练结合头穴丛刺对ASD大鼠行为学症状及炎性因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SPF 级健康成年Wistar 大鼠，其中雌性16只，体质量(250±10) g，雄性8只，体质量(290±10) g，均购于黑龙江中医药大学动物实验中心(批号20210321)，实验动物使用许可证号SYXK(黑)2020-004。大鼠饲养于黑龙江中医药大学脑功能与神经康复实验室。饲养环境保持温度(22±2) ℃，湿度(50±10)%，自然昼夜节律变化光照，国家标准大鼠生长繁殖饲料饲养，自由饮用食水。本研究对动物的处理严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 模型制备及分组

适应性饲养1 周后，当日20:00 按雌雄比2∶1 进行合笼，次日晨8:00 进行阴道涂片，显微镜下观察是否受精，将母鼠受精的当天记为妊娠第0.5 天。将受孕母鼠随机分为对照组母鼠(n= 2)和实验组母鼠(n=6)，参考Schneider 等[9]的方法建立动物实验模型。实验组在妊娠第12.5 天时腹腔注射丙戊酸钠(valproic acid, VPA) 600 mg/kg，按250 mg/mL 溶解于0.9%氯化钠溶液，对照组孕鼠同等时间注射同等剂量的氯化钠溶液。子鼠出生当天记为1 d，选取雄性子鼠于生后7～21 d 持续进行生长发育学测试，评估造模是否成功。实验组母鼠产下雄性后代即为孤独症行为异常模型鼠，随机选出24 只分为模型组(n= 6)、丰富环境组(n= 6)、头穴丛刺组(n= 6)和丰富环境结合头穴丛刺组(n= 6)。对照组母鼠产下雄性后代即为正常大鼠，随机选出6只作为对照组。

1.3 主要仪器和试剂

行为学检测系统：Smart 3.0 行为学分析软件。行为学检测箱：哈尔滨道外区宏大有机玻璃经销部。丰富环境训练箱：哈尔滨振发有机玻璃厂。生物显微镜：日本NIKON 公司。台式高速冷冻离心机：长沙英泰仪器有限公司。一次性无菌针灸针：直径0.25 mm，长13 mm，苏州华佗医疗器械有限公司。VPA： 美 国SIGMA-ALDRICH 生 物 公 司。 IL-6、IL-1β ELISA 试剂盒：北京诚林生物公司(批号E-30644；E-30418)。

1.4 干预方法

对照组和模型组不进行任何干预，给予同等条件活动。其他3 组在生后第21 天开始干预。每天1 次，每周6 d，共4周。

丰富环境组置于丰富环境训练笼中1 h。参照Nithianantharajah 等[10]将丰富环境训练笼设置为70 cm×60 cm×50 cm 的透明有机玻璃箱，内部放置刺激运动、气味、触觉和听觉的物品，如彩色小球、柠檬、音响等，同时融合6只陌生正常同龄雌鼠。

头穴丛刺组参照《实验针灸学》选取百会穴及其左右两侧旁开5 mm 处，从头后向前额进行丛刺，深5～10 mm，快速捻转20 s后留针1 h。

丰富环境结合头穴丛刺组：给予大鼠头穴丛刺长留针的同时，将其置于丰富环境训练笼中干预1 h。

1.5 动物行为学检测

在生后第42天对各组进行行为学测试。

1.5.1 社交能力指数和社交偏好指数

三箱实验[11]是评估大鼠社交行为的常用方法。

测试箱采用70 cm×60 cm×50 cm 的顶部开口长方体亚克力箱，两块中下部开口(允许动物在箱内自由活动)的透明亚克力板将箱内空间均分为3份，箱内两侧箱格对角放置直径5 cm、高20 cm 的金属笼，用来放置陌生鼠。摄像头置于箱体上方全程采集视频。实验前7 d 对待测鼠进行适应性训练，第8 天正式开始实验。

实验分为两个阶段。第一个阶段为社交能力测试，陌生鼠1 放入右侧箱格金属笼中，左侧箱格放入空笼，将测试鼠放入中间箱格，测试10 min；结束后立即进行第二阶段测试，即社交偏好测试，陌生鼠1不取出，陌生鼠2 放在空笼中，随即调换两个金属笼的位置，再将被测鼠放入中间箱格测试10 min。采用Smart 3.0 行为学分析软件记录和分析测试鼠在3 个箱格中的活动时间、sniff 时间和活动轨迹等信息。为避免干扰，在每只鼠测试后都用75%酒精棉擦拭箱体，晾干后再进行下一只鼠的测试。

1.5.2 重复刻板行为

埋珠实验[12]主要用于测试大鼠的刻板行为。

提前1 h 把大鼠送入测试箱以适应环境。用75%酒精和水擦拭标准鼠箱，并用纸巾擦干，底部垫料厚5 cm，垫料表面按4×5 的方式均匀摆放20 个大理石球(直径1 cm)，放入待测鼠，盖上盖子，30 min 后将其取出，统计暴露体积大于1/2 的大理石球的个数，以及被埋大理石球的个数。为避免干扰，每只鼠测试后对箱体及垫料进行酒精消毒去味，待酒精挥发后进行下一只鼠的测试。

1.6 血清炎性因子IL-6和IL-1β水平测定

各组大鼠全部完成行为学测试后，腹腔注射10%水合氯醛350～400 mg/kg 麻醉大鼠，取眼球血约3～4 mL，室温下静置2 h，4 ℃、3 000 r/min 离心15 min，取离心后的淡黄色上清液，1.5 mL 离心管分装，采用ELISA 法测定血清IL-1β 和IL-6 水平。实验步骤按试剂盒说明书操作。

1.7 统计学分析

采用SPSS 27.0 进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以(±s)表示。组间均数比较采用ANOVA 方差分析，进一步两两比较采用LSD 检验。显著性水平α= 0.05。

2 结果

2.1 动物行为学检测

2.1.1 社交能力指数和社交偏好指数

与对照组比较，模型组社交能力指数和社交偏好指数均降低(P＜ 0.05)。与模型组比较，丰富环境组、头穴丛刺组和丰富环境结合头穴丛刺组社交能力指数和社交偏好指数均提高(P＜ 0.05)，丰富环境结合头穴丛刺组优于头穴丛刺组和丰富环境组(P＜ 0.05)。见表1、图1和图2。

图1 各组三箱实验社交能力结果Figure 1 Sociability results of three-chamber text in each group

2.1.2 重复刻板行为

与对照组比较，模型组挖掘掩埋动作频繁，埋珠数量多(P＜ 0.05)。与模型组比较，丰富环境组、头穴丛刺组和丰富环境结合头穴丛刺组埋珠数量减少(P＜0.05)，与丰富环境组、头穴丛刺组相比，丰富环境结合头穴丛刺组埋珠数量下降(P＜ 0.05)。见表2。

表2 各组埋珠实验结果Table 2 Comparision of marble burying results among groups

2.2 血清炎性因子IL-6、IL-1β水平

与对照组比较，模型组外周血清炎性因子IL-6 和IL-1β 水平升高(P＜ 0.05)；与模型组比较，丰富环境组、头穴丛刺组和丰富环境结合头穴丛刺组外周血清炎性因子IL-6 和IL-1β 水平下降(P＜ 0.05)，丰富环境结合头穴丛刺组IL-6 和IL-1β 水平低于丰富环境组和头穴丛刺组(P＜ 0.05)。见表3。

表3 各组血清炎性因子IL-6、IL-1β水平Table 3 Comparision of serum levels of inflammatory factors IL-6 and IL-1β among groups单位：ng/L

3 讨论

VPA 建立ASD 模型已被众多研究证实在解剖学、病理学、病因学方面与人类数据有显著的相似之处[13]。2005 年，Schneider 等[9]首次从行为学角度证实VPA 建立孤独症模型的有效性。Schneider 团队发现VPA建立的ASD大鼠模型生长发育较迟缓，对疼痛的敏感度降低，社交行为数量减少，运动和重复/刻板行为以及焦虑增加，这种行为改变与人类ASD行为障碍的特征有显著相似之处。后续许多研究采用不同的行为测量工具，如三箱实验检测ASD大鼠社交能力，埋珠实验检测其重复刻板行为，旷场实验检测其焦虑情绪，均得到与Schneider 等相同的结论[14-15]。目前该模型的行为学表现已作为评估手段广泛应用于ASD的行为学研究中。

ASD 患儿的行为学症状与大脑神经生物学改变和外部环境刺激有关。丰富环境训练通过感觉、触觉、视觉、听觉、运动、空间以及同伴等丰富的刺激，有利于改善ASD 大鼠的社交能力[5]。通过调节基底神经节选择核中的神经元代谢活性，增加树突棘密度，或者增加神经营养因子或突触蛋白表达来改善神经可塑性和神经递质系统，减少炎症和氧化应激，从而改善小鼠重复刻板行为、社交功能缺陷以及认知功能障碍等症状[16-18]。一项为期17 周的BTBRT+Itpr3tf/J 小鼠丰富环境训练研究显示，三箱实验中丰富环境组雄鼠社交偏好和社交能力较模型组有显著提升[19]。

头穴丛刺直接作用于大脑体表投影区，可以改善局部血供，调节大脑氧和葡萄糖代谢，增强神经兴奋性，减少炎症反应，留针达到一定刺激量时可以促进神经功能重组，改善相应的异常行为，在脑部发育关键时期效果尤甚[20-23]。此外，头穴丛刺通过上调海马中神经调节蛋白1 和表皮生长因子4 受体表达、调节额叶皮质相关激素水平，如催产素、5-羟色胺来改善ASD 大鼠的行为学症状[24-25]。一项关于头穴丛刺治疗ASD 的Meta 分析显示，头穴丛刺是减轻ASD 严重程度、改善ASD 行为症状的有效治疗方法[26]。本研究显示，干预后各组社交能力指数和社交偏好指数改善，重复刻板行为减少，丰富环境训练结合头穴丛刺效果更好。

ASD 是一组异质性神经发育综合征，与免疫系统失调和炎症反应异常密切相关[27]。IL-6 是参与脑发育的重要免疫因子，外周血液IL-6 的升高可以通过神经解剖结构和神经可塑性的损伤介导孤独症样行为[28]。IL-1β 通过淋巴细胞和巨噬细胞激活触发炎症反应。有研究发现，ASD 患儿单核细胞损伤并导致体内免疫反应发生改变，使促炎因子IL-1β 和IL-6 异常增多，与抑炎因子IL-10 处于不平衡状态，进而促使ASD 患儿异常行为的出现[29]。本研究显示，丰富环境训练结合头穴丛刺能够下调孤独症大鼠血清中促炎因子IL-6和IL-1β 的表达，减轻外周炎性状态。这与赵晓倩等[30]的研究结果一致。

4 结论

丰富环境训练结合头穴丛刺能够改善孤独症大鼠行为学症状，降低周围血清炎性因子表达，两者联合应用效果更佳，但具体机制仍需进一步研究。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。