中医药防治肿瘤铁死亡的研究进展

朱青，陈龙菊

湖北民族大学 湖北恩施 445000

细胞死亡是细胞生命过程中的基本特征，利用这一特征可用于恶性肿瘤治疗的研究。了解控制细胞死亡的机制对于防治肿瘤的发展至关重要。铁是人体内最丰富及维持机体生命活动必需的微量元素之一，在生命代谢过程中意义深远。正常细胞铁代谢处于一个不断吸收、利用、储存、循环的动态平衡中，即铁稳态，其作用主要表现在维持细胞的正常生理功能。当细胞中铁稳态遭到破坏，就会导致细胞内铁过载。过量的铁通过芬顿（Fenton）反应产生活性氧可以诱导细胞发生一种不同于凋亡、自噬、坏死的程序性细胞死亡方式——铁死亡，其先决条件可能与含多不饱和脂肪酸磷脂（PUFA-PL）的合成及过氧化、铁代谢和线粒体代 谢有关，而其防御系统可能与GPX4-GSH、FSP1-CoQH2、DHODH-CoQH2、GCH1-BH4 有关，当促进铁死亡的细胞活性显著超过铁死亡防御系统提供的解毒能力时，细胞膜上脂质过氧化物的致命积累导致随后的膜破裂和细胞铁死亡[1]。铁是DNA合成过程中的主要限速因素。肿瘤细胞由于需要迅速增殖，比正常细胞对铁有更高的需求，这使得肿瘤细胞在铁稳态失衡时，比正常细胞对铁死亡更加敏感[2]。高水平铁代谢是肿瘤细胞主要的表现之一，因此，研究铁死亡在抗肿瘤应用方面具有潜在的优势。本文综述中医药防治肿瘤铁死亡的研究进展，为肿瘤的治疗提供新思路。

铁死亡与肿瘤治疗

Dolma 等[3]于2003 年在对大鼠肉瘤基因突变的肿瘤细胞研究时发现，新化合物Erastin 导致的细胞死亡且与细胞凋亡有着明显区别且caspase 抑制剂不能阻断。Yang 等[4]于2008 年研究发现RAS-selective lethal 3（RSL3）和RAS-selective lethal 5（RSL5）也可以触发这类型的细胞死亡，其诱导的细胞死亡可被铁螯合剂（DFO）和抗氧化剂（Vitamin E）抑制。2012年，Dixon 等[5]用铁死亡命名了这种细胞死亡方式，同时还确定了铁抑素-1（ferrostatin-1，Fer-1）化合物，作为HT-1080 细胞中erastin 诱导的铁死亡的最有效抑制剂。铁死亡在形态学上，线粒体体积减小、嵴减少或消失、膜密度增加、外膜破裂，而细胞质膜不破裂，细胞核大小不变；在生化特征上，铁离子积累、ROS 聚集以及脂质过氧化[6]。脂质氧化物堆积，谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）催化的谷胱甘肽（GSH）还原反应不能将其代谢，继而Fe2+触发芬顿反应导致大量活性氧（ROS），诱导铁死亡的发生[7]。在铁死亡复杂的调控机制中，由于GPX4 是清除脂质过氧化物的酶，抑制其可以直接诱导细胞铁死亡，而GSH 是GPX4 催化过氧化物的辅助因子[8]，所以GPX4/GSH 通路在铁死亡的机制研究中较为重要。胱氨酸-谷氨酸反向转运体（System-Xc）可将胱氨酸还原为半胱氨酸，参与合成GSH 并将其合成原料转运入细胞内，因此间接成为GSH 合成的限制因素，是许多铁死亡诱导剂的作用靶点[9]，该通路是铁死亡众多机制中最为经典的通路。研究发现对于肿瘤铁死亡分子机制还有铁积累、脂肪酸积累和甲羟戊酸途径抑制 GPX4 的合成等多种途径[10]。细胞死亡对于正常发育、体内平衡和预防恶性肿瘤等过度增殖性疾病至关重要，通过过氧化物、铁或多不饱和脂肪酸过载，诱导脂质过氧化等方法实现，达到清除特定细胞群（如特定肿瘤类型）的目的是目前研究的热点。

恶性肿瘤已经成为全球第2 大死亡原因，发病和死亡例数也逐年上升，寻求预防和控制的相关办法十分重要[11]。研究表明，具有特定细胞状态的癌细胞容易发生铁死亡，例如处于间充质状态的癌细胞由于ZEB1 的高表达而富含PUFA-PL，提示肿瘤细胞更容易受到铁死亡的影响[12]。与正常细胞相比，肿瘤细胞对细胞内高水平的ROS 更敏感，常用的化疗药物如铂类、紫杉烷类等均可通过诱导细胞产生大量ROS，从而激活铁死亡相关通路，促使肿瘤细胞死亡[13]。但是化疗药物大剂量给药容易引起胃肠道反应、骨髓抑制、肝肾功能损害等并发症，对患者正常生活造成一定影响[14]。

中药提取物对肿瘤铁死亡的应用

在历史古籍中，应用中医药抗肿瘤的记载数不胜数，随着现代科技的发展，中药提取物作为一种采用先进的工艺技术对中药材或中药复方进行提取分离加工而得到的具有相对明确药效的物质基础，逐渐被人们应用研究。近几年，中药提取物在肿瘤铁死亡的研究展现出巨大的研究前景。通过既往文献报道可知，从铁死亡途径干预肿瘤疾病的单体及提取物研究较多，见表1。

表1 中草药的活性成分从铁死亡途径干预肿瘤疾病

1 山豆根提取物对Nrf2 的反向调控机制

Nrf2 作为调节氧化还原的核转录因子，控制细胞内氧化还原平衡蛋白（如GPX4 和SLC7A11）的表达，下调Nrf2 可以促使铁死亡的发生[18]。而山豆根提取物——苦参碱[20]研究发现可以激活PERK，其作为Nrf2 的上游结构，可以调控Nrf2 表达增加，进而促进下游HO-1 的表达，抑制SLC7A11、GPX4 的表达，诱导CNE1 铁死亡。有报道[20]称PERK 激活后磷酸化转录因子Nrf2，促使Nrf2 / Keap1 复合物解离后核转录，可与抗氧化反应元件（ARE）相互作用并激活各种基因，包括HO-1，GCLM，SLC7A11，GCLC，FTH1，ATF6，NQO1，GAPDH 和ATF3，以及Nrf2 本身内质网应激和未折叠蛋白反应都被记录为与肿瘤的发展有关，其中HO-1 是一种内质网锚定的酶，可将血红素代谢为促氧化亚铁，高表达时促进铁积累和 ROS 生成。山豆根作为一种清热解毒的药物，其对Nrf2 的调节作用可能与激活HO-1 有关。

2 GPX4 泛素化影响

瓜蒂的活性成分葫芦素B[21]对Huh-7 的SLC7A11，Transferrin，SLC40A1 表达变化较小，而GPX4表达明显抑制，且Nrf2 和HO-1 的蛋白表达也明显降低，依据这一特点使用免疫共沉淀法检测发现葫芦素B 可以加速GPX4 的泛素化和降解，从而起到铁死亡的作用。β-榄香烯[22]处理A549，NCI-H460，SPC-A-1 同样能促进GPX4 的泛素化，且联合转录因子TFEB（是自噬-溶酶体途径的主要调节因子）过表状态时结果更为明显，表明TFEB 促进了β-榄香烯诱导的GPX4 溶酶体降解，两者结合并激活TFEB从而介导其诱导的铁死亡发生。对GPX4 泛素化的研究表明多种途径都可以造成脂质过氧化GPX4 过表达，并不是单一的从半胱氨酸途径发生的铁死亡。探讨α-常春藤皂苷[27]诱导Bel-7402 铁死亡的可能机制与下调xCT 和GPX4 的表达，上调DMT1 的表达有关。当细胞内铁代谢紊乱，二价金属转运蛋白DMT1 转运更多的Fe2+到细胞质不稳定的铁池中，促使fenton 反应生成ROS 堆积诱发铁死亡，DMT1 也是检测铁死亡的一个关键指标。FHC（又称FTH1），铁蛋白重链FHC 是一种铁结合蛋白，在宿主防御氧化应激方面起着重要作用[29]。细胞色素C 氧化酶（COX）是线粒体电子传递链的末端酶，线粒体电子传递链的破坏会导致电子泄露，诱导线粒体ROS 的产生[30]，COX2 可作为一种检测铁死亡的敏感蛋白[28]，提示线粒体的受损和铁死亡的发生。FACL4 又称酰基辅酶A 合成酶长链家族成员4（ACSL4）是多不饱和脂肪酸（PUFAs）代谢的重要同工酶。ACSL4 是脂质生物合成的重要酶，也有助于铁死亡的执行，含铁酶脂氧合酶通过产生脂质氢过氧化物是铁死亡的主要启动子，其功能依赖于ACSL4 依赖性脂质生物合成的激活[34]。GPX4，SLC7A11 和FTH1 被认为是铁死亡负调节特征的相关基因，它们的表达抑制意味着铁死亡的发生[35]。铁死亡的检测指标多种多样，而GPX4 是其中的关键性指标，对于致使GPX4 降低的途径，近来发现还可以通过泛素化对其影响，是研究中药活性成分对铁死亡影响的新发现，但是也有实验发现GPX4 上调也意味着铁死亡的发生，是细胞内部氧化应激发生激烈反应的表现，未来还有待更多的中药成分研究验证。

3 众多中药活性成分参与p53 的调控机制

众多实验表明p53 参与了铁死亡的进展，对于p53 的研究发现，p53 肿瘤抑制途径的失活是大多数人类恶性肿瘤形成的关键事件，p53 蛋白通过作为选择性调节某些p53 转录靶基因表达的DNA 结合转录因子来实现其多样化的细胞结果，经过实验研究发现SLC7A11 基因是p53 介导的转录抑制的靶标，当p53被沉默时，SLC7A11 的下调被解除[36]。另有研究发现，巴伐钦通过STAT3/P53/SLC7A11 轴诱导铁死亡[42]。信号转导器和转录激活因子3（STAT3）属于STAT家族，是参与肿瘤进展的重要转录因子。实验研究表明，Nrf2 和STAT3 通过调节SLC7A11 在铁死亡中起关键作用[43]，目前发现的中药活性成分对P53 的研究主要集中在清热药（如连翘、重楼、黄芩等）、杀虫药（如土荆皮、毛泡桐、藤黄等）、少部分在活血药（如丹参）、补虚药（如补骨脂）。

4 中药活性成分参与铁死亡与铁自噬的研究

另有少数实验对自噬与铁死亡进行了研究，槐耳提取物[45]对SW620 基于（半）胱氨酸/GSH/GPX4 轴为基础进一步研究了HMGB1 做为自噬调节剂及信号传导因子也参与细胞的铁死亡。这是中药单体或提取物对自噬在铁死亡中的初步探讨。自噬根据降解底物有无专一性，可分为选择性与非选择性自噬，铁自噬是一种特殊类型的铁蛋白选择性自噬降解，过度激活铁自噬会导致细胞内铁过载，增加细胞对铁死亡的敏感性，从而诱导GSH 耗竭和GPX4 的减少，导致铁死亡的发生。在HepG2 和Hep3B 中均观察到重楼皂苷Ⅱ通过NCOA4/FTH1 铁蛋白吞噬诱导铁死亡[46]。NCOA4 是负责铁蛋白吞噬降解铁蛋白的载体，高水平表达的NCOA4 细胞更容易对铁蛋白自噬敏感，NCOA4/FTH1 是介导铁离子释放的主要过程，是一种调节细胞内铁离子含量的选择性自噬方式。《药性论》记载槐耳具有破血之功效，《神农本草经》记载重楼具有清热解毒、消肿止痛之功效，抗肿瘤治疗中主要以活血及清热解毒消肿为主，符合用药原则，而目前对于铁自噬的研究主要以这类药物为主，未来有望进一步研究发现这一类药物对铁自噬的共性。

查阅近几年文献，综上可见，目前中药单体或提取物对铁死亡抗癌的实验研究主要集中在SLC7A11/GPX4 这一条经典的抗氧化系统，相关检测指标表现为铁离子、ROS、MDA 含量的增加，GSH、SOD 含量的降低，且抗氧化抑制剂、铁死亡抑制剂等均可逆转其铁死亡的现象，而对于铁自噬与铁死亡的实验[47]通过与正常细胞的毒性试验对比验证了中药单体或提取物在发挥铁死亡抗肿瘤的安全性，为中药抗肿瘤安全性提供了理论依据。以上药物主要集中在补虚、清热解毒、活血化瘀等角度，符合肿瘤的病因病机，体现中医药治疗特色。以不同肿瘤的相似研究作为参考范式，对中医药参与肿瘤疾病的诊治同样具有借鉴意义。

中药复方对肿瘤铁死亡的应用

1 左金丸

左金丸源自《丹溪心法》黄连与吴茱萸以6∶1为比例配对而成方。卫真真等[48]对SW620、LoVo、HCT116、HT29 和Caco2（均为人结肠癌细胞株）使用西妥昔单抗单独对铁死亡相关蛋白水平的表达没有明显的改变，但是联合左金丸（黄连、吴茱萸）使用时Nrf2、SLC7A11、GPX4、MDM2 呈浓度依赖性减少，p53 呈浓度依赖性增强，且在使用凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、坏死抑制剂necrostatin-1 条件下不能逆转细胞死亡，当使用了铁死亡抑制剂fer-1 西妥昔单抗对结肠癌耐药的作用再次被表达，表明左金丸可通过诱导铁死亡增强KRAS 突变型肠癌细胞并增强对西妥昔单抗的敏感性。

2 固本消积方

还有研究者[49-51]研究国医大师潘敏求“肝复方”化裁而来的固本消积方（人参、黄芪、白术、茯苓、莪术、土鳖虫、石见穿、预知子、重楼、半枝莲）含药血浆诱导HepG2（人肝癌细胞）铁死亡发现可通过调节 p62/Keapl/NRF2 通路；或是调节GPX4 实现肝癌铁死亡，还进一步探索了TRPV1 与GPX4 的关系，生信统计在肝癌中TRPV1 与GPX4 呈负相关，即激活TRPV1 可以抑制GPX4 的表达，实验使用TRPV1 拮抗剂对GPX4 蛋白表达检测发现固本消积方干预后的表达量低于拮抗剂干预后的；或是通过调节ACSL4、LPCAT3、LOX、NOX1 等脂质过氧化关键蛋白的表达诱导肝癌铁死亡。上述组方立足抗氧化系统和脂肪酸积累途径两条通路展现了铁死亡在抗肿瘤中的作用，极大的丰富了中药组方在铁死亡调控中的药用谱，体现了具有多靶点、多通路协同作用的优势。

小结与展望

铁死亡的研究逐渐增多，前期主要是化合物的研究，近年来，中药作为天然化合物的研究越来越流行，目前国内外主流研究主要是基于中药单体或者是提纯物的研究，中药复方对肿瘤铁死亡的研究相对较少，可能与肿瘤复杂的病机有关，并没有过多明确的组方用之，未来可以立足名老中医经验的总结更多探索。鉴于铁死亡中观察到的独特特征，有可能建立新的潜在的抗癌治疗，可能克服与特定凋亡信号通路的失活或耐药癌细胞中遇到的改变靶点相关的多药耐药现象。GPX4 和System-Xc 作为协调铁死亡过程的关键，大多数实验主要是基于此系统的研究，结合国外目前的研究发现，还有脂肪酸积累、铁积累与铁自噬、甲羟戊酸等途径，还有待更多的单体提纯物或复方去进一步研究，丰富中医药铁死亡抗肿瘤的机制研究，为中医药抗肿瘤提供更多的理论依据。