一株适用于短程反硝化的细菌筛选及其脱氮特性

张建美，朱永茂，谢健强，吕钰楠，梅江雪，蒋兴超

（1.长江大学资源与环境学院，湖北武汉 430100；2.长江大学油气地球化学与环境湖北省重点实验室，湖北武汉 430100）

近些年来，随着人们对污水处理认知的不断深入以及污水脱氮研究的进一步发展，一些新型脱氮方法不断出现，厌氧氨氧化（ANAMMOX）是指厌氧氨氧化菌在厌氧条件下，以NH4+-N为电子供体，以NO2--N为电子受体生成N2的过程，该反应具有能耗低、脱氮效果好、剩余污泥少等优点，成为污水处理行业的研究热点〔1-2〕。一般污水中NO2--N浓度较低，难以维持ANAMMOX的持续进行，如何获得稳定的NO2--N积累是该工艺能否被广泛应用的关键。短 程 硝 化（Partial nitrification，PN）常 被 用 做ANAMMOX的前置工艺〔3-4〕，但该工艺对环境条件要求严苛，长期运行过程中难以保证NO2--N的稳定积累，使ANAMMOX工艺面临崩溃风险〔5〕。短程反硝化（Partial denitrification，PD）是指将NO3--N仅还原到NO2--N阶段，未进一步还原为N2的过程，因其具有更加稳定的NO2--N积累广受关注〔6-9〕。

J.S.ALMEIDA等〔10〕认为PD的发生与硝酸盐还原酶（Nitrate reductase，Nar）和亚硝酸盐还原酶（Nitrite reductase，Nir）对碳源所提供电子的竞争有关，若Nar在竞争中占据优势，则反硝化过程中能实现高的NO2--N积累。前期研究表明，碳源类型、C/N、pH、温度等环境因素都会对Nar和Nir的活性产生影响，从而引起不同程度的NO2--N积累〔11-14〕。除环境条件的影响外，反硝化细菌的群落结构对于NO2--N的积累也至关重要，自然界中反硝化细菌种类繁多，一类反硝化细菌仅能进行PD，以NO2--N为最终产物，另一类反硝化细菌可以同时还原NO3--N和NO2--N，无NO2--N积累，还有一类反硝化细菌尽管可以同时还原NO3--N和NO2--N，但NO2--N的还原速率较慢，仍可实现NO2--N的积累〔15-16〕。如果能富集和筛选出易于进行PD的细菌，则可为短程反硝化-厌氧氨氧化（Partial denitrification ANAMMOX，PD/A）耦合工艺的实际应用提供重要支撑。

本研究采集活性污泥以及水稻田土壤样品，筛选易于进行PD的细菌，并对影响菌株NO2--N积累的环境因子进行了探析，以期为PD/A耦合新型脱氮工艺提供潜在菌株。

1 材料及方法

1.1 样品采集

取蔡甸污水处理厂二沉池活性污泥样品，其悬浮固体（SS）质量浓度为2 870 mg/L，另外取长江大学周边水稻田表层下5 cm土壤，带回实验室进行菌株的富集和分离。

1.2 培养基

富集培养基：KNO31.0 g，葡萄糖5.0 g，KH2PO43.75 g，Na2HPO40.98 g，MgSO4·7H2O 30 mg，定 容至1 000 mL，调节pH在7.0～8.0。

分离 培 养 基：KNO31.0 g，葡 萄 糖5 g，KH2PO43.75 g，Na2HPO40.98 g，MgSO4·7H2O 30 mg，定 容至1 000 mL，调 节pH在7.0～8.0，加 入1.5%～2.0%的琼脂。

纯化 培养基：牛肉膏0.5 g，蛋白 胨1.0 g，NaCl 0.5 g，定 容 至1 000 mL，调 节pH在7.0～8.0，加 入1.5%～2.0%的琼脂。

反硝 化 培 养 基：KNO31.0 g，KH2PO43.75 g，Na2HPO40.98 g，MgSO4·7H2O 30 mg，柠檬酸钠4.6 g，定容至1 000 mL，调节pH在7.0～8.0。

微量元素：EDTA 50 g，CuSO4·5H2O 1.5 g，CaCl25.5 g，CoCl2.6H2O 1.61 g，FeSO4.7H2O 5 g，ZnSO42.2 g，定容至1 000 mL。

1.3 菌株筛选

1.3.1 菌株分离纯化

称量10 g水稻田土壤，加入100 mL无菌水，磁力搅拌器震荡10 min，取5 mL土壤悬浮液和5 mL活性污泥样品分别接种到100 mL富集培养基中，于30 ℃下厌氧摇床培养3 d，重复富集3次。之后将菌液浓度分别稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7这5个量级，均匀涂至分离培养基平板上，30 ℃下于厌氧培养罐中倒置培养。待平板长出菌落后，挑选形态大小各异的菌落用划线培养法进行分离、纯化至无杂菌生长，菌株保藏备用。

1.3.2 菌株筛选

经过富集分离纯化后，得到形态不同的单菌落，挑选这些单菌落在试管内进行液体厌氧培养，72 h后，测定试管内NO3--N以及NO2--N浓度，从而获得反硝化效率高的4株菌株H6、H7、D5、D9。之后对该4株菌株进行NO3--N还原性能测试，选择柠檬酸钠为碳源，C/N控制在8，30 ℃下厌氧培养，定期取样测试OD600、NO3--N和NO2--N浓度，筛选出PD效果好的菌株。

1.3.3 菌株的鉴定

选择PD性能优良的菌株D5，从形态学以及16S rDNA序列方面对菌株进行鉴定。

1）菌株形态。用平板划线法和扫描电镜（SEM）观察所选菌株D5的形态结构。将菌株接种于反硝化培养基中培养，取2 mL菌液离心，倒掉上清液，加入预冷的2.5%戊二醛溶液固定24 h后用扫描电镜观察菌株细胞形态。

2）菌株的PCR扩增。用细菌DNA提取盒提取菌株D5的DNA，然后以基因组DNA为模板，利用细菌 通 用 引 物27F（5'-TTC CGG TTG ATC CTG CCG GA-3'）和1492R（5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'） 进行PCR扩增，之后由中国典型培养物保藏中心测序，测序结果在NCBI数据库通过Blast软件进行同源性比较并用Mega构建系统发育树。

1.4 不同环境因子对菌株D5脱氮的影响

1.4.1 碳源

选取酒石酸钾钠、乙酸钠和柠檬酸钠为碳源，配制NO3--N质量浓度为120.01 mg/L，C/N为8的反硝化培养液，分别取300 mL加入到500 mL厌氧瓶内，120 ℃灭菌15 min，冷却后接种5 mL D5菌液，通高纯氮气20 min除氧，密封，于30 ℃下进行摇床实验。定期取水样检测分析NO3--N和NO2--N，研究碳源对菌株D5脱氮的影响。

1.4.2 C/N

选择柠檬酸钠为碳源，配制C/N分别为0.8、1、2、3、5的培养液，按1.4.1实验步骤于30 ℃下厌氧培养，定期取水样分析NO3--N和NO2--N，研究C/N对菌株D5脱氮的影响。

1.4.3 温度

设置3个温度分别为15、25、30 ℃，控制C/N为5，按1.4.1实验步骤接种D5于反硝化培养液中，厌氧环境下进行实验，定期取水样分析NO3--N和NO2--N，研究温度对菌株D5脱氮性能的影响。

1.5 分析方法

pH采用pH计测定（上海雷磁公司pHS-3E型）；DO采用110溶解氧仪测定（上海雷磁公司JPSJ-605F型）；OD600采用分光光度计测定（岛津公司UV-1100型）；NO3--N采用紫外分光光度法；NO2--N采用分光光度法。水样分析前均用0.45 μm膜进行过滤处理。

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选

经过富集分离纯化后，得到24株形态不同的单菌落，挑选这些单菌落在试管内进行厌氧反硝化实验，根据NO3--N还原能力和自身生长繁殖速度，选取H6、H7、D5、D9共4株菌株，并进一步评价了这4株菌株的反硝化性能以及NO2--N积累能力，结果见图1。

图1 不同菌株的反硝化脱氮过程Fig.1 Nitrogen removal of different strains

由图1（a）可见，H7、D5、D9菌株的NO3--N去除规律类似，实验开始后NO3--N的去除效果明显，在24 h内NO3--N质量浓度迅速降低到8.69、14.92、23.29 mg/L，去除率达到94.5%、90.5%、85.2%，在6～24 h内菌株OD600也显著增加至0.825、0.765、0.743〔图1（c）〕，实验结束时，NO3--N去除率均大于90%。H6对硝酸盐的去除呈现出不同的趋势，实验初始阶段NO3--N浓度降低较慢，实验进行60 h后，硝酸盐去除率仅为40.8%，之后迅速降低，到实验结束时，去除率为88.4%。由OD600也可以看出H6生长较为缓慢，36 h时仅为0.302，之后进入快速生长期。该结果表明，在该实验条件下菌株H6的适应期较长，但随着实验的进行，仍然具有较高的NO3--N去除率。

整个实验过程中，各菌株均有不同程度的NO2--N积累〔图1（b）〕，H7、D5、D9积累NO2--N的规律一致，实验开始后，系统内的NO2--N浓度迅速升高，24 h时达到最大值，依次为91.70、95.70、94.70 mg/L，之后下降，从36 h开始直到实验结束，质量浓度分别维持在（44.00±2.40）、（42.94±5.16）、（42.79±3.82） mg/L之间。由以上数据可以判断，菌株H7、D5、D9在还原NO3--N的过程中，易于发生PD，从而引起显著的NO2--N积累。H6则呈现出不同的现象，在整个实验过程中NO2--N的积累量轻微，36 h时质量浓度仅为3.94 mg/L，远低于H7、D5、D9的积累量，72 h时已无NO2--N检出，这充分表明菌株H6进行的是完全反硝化作用，NO2--N难以积累。

实验过程中NO3--N的还原条件一致，细菌种类的不同是引起NO2--N积累程度差异的主要原因，菌株H7、D5、D9在还原硝酸盐过程中，PD作用明显，NO2--N积累量大，而H6在整个实验过程中反硝化作用彻底，NO2--N积累轻微。Rui DU等〔17〕研究发现Thauera属的反硝化细菌含有的Nir反硝化基因丰度要远低于Nar，判断Thauera属进行的反硝化作用为阶段性反硝化反应。据此推测H7、D5、D9菌株中含有Nir反硝化基因，但其活性低于Nar，致使NO3--N被还原为NO2--N后，不能及时进行下一步的转化，从而引起NO2--N的积累，相反H6中含有的Nar丰度高于Nir，在反硝化过程中产生的NO2--N能被及时还原。

由上面的分析可知，D5菌株PD效果显著，NO3--N去除率高，NO2--N积累明显，选为后续研究的菌株。

2.2 菌株的鉴定

菌株D5的形态特征为菌落较大、圆形、浅黄色、表面光滑、湿润、易挑取。经鉴定该菌株为杆状细菌。

将菌株D5的16S rDNA进行Blast分析，发现菌株D5与Klebsiella quasipneumoniae、Klebsiella pneumoniae的相似度均达到99%以上。另外由系统发育树（图2）可见，菌株D5跟Klebsiella pneumoniae的亲缘关系最近，结合菌株的形态学特性，鉴定分离的菌株D5为克雷伯氏菌属（Klebsiellasp.）、肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）。该菌株在人体肠道、动物血液和内脏等分离的比较多，以往的研究主要针对人体健康及耐药性等方面〔18〕。在污水处理系统中，常见的反硝化细菌包括假单胞菌属（Pseudomonas）、陶厄氏菌属（Thauera）和不动杆菌属（Acinetobacter）等〔19〕。本研究筛选的D5来自水稻田土壤，不属于污水处理中的常见反硝化细菌，但是先前也有一些研究筛选出了Klebsiellasp.反硝化细菌〔20〕，例如刘咏等〔21〕从巢湖芦苇湿地分离筛选出一株异养反硝化细菌，命名为Klebsiellasp.DB-1，能够有效地去除水中NO3--N，中间有NO2--N积累，但是72 h后NO2--N快速被分解掉。封勇等〔22〕筛选出的肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）具有降解铵盐、硝酸盐和亚硝酸盐的作用，24 h 内的降解率分别为 96%、100%、100%，中间过程有NO2--N积累，但是在18 h被完全降解掉。而本实验筛选出的菌株PD作用明显，尽管实验后期NO2--N的积累量有所降低，但直到实验结束，仍保持一个较高的浓度水平。与以往资料中筛选出的Klebsiellasp.相比，菌株D5更易积累NO2--N，这可能与菌株的Nar与Nir活性 相 关，刘 咏 等〔21〕认 为 菌 株Klebsiellasp.DB-1的Nar合成与Nir合成并不协调，72 h后Nir大量合成，将积累的亚硝酸盐快速还原，据此推测本实验过程中，菌株D5并未大量合成Nir，Nir活性低，NO2--N积累较为稳定。

图2 基于16S r DNA分析的菌株D5的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain D5 based on 16S r DNA analysis

2.3 环境因子对菌株D5性能的影响

PD的实现跟反硝化细菌内的Nar与Nir对供应电子的竞争有关，通过环境条件的调控可针对性干预Nar与Nir的竞争，提升Nar的活性，同时抑制Nir的活性，便可取得好的PD效果，使NO2--N稳定积累。

2.3.1 碳源

大部分反硝化细菌都需要依靠外界碳源作为电子供体还原NO3--N，不同类型污水中的有机物种类不同，反硝化菌对其利用能力存在差异，进而影响NO2--N的积累〔23-24〕。碳源对菌株D5反硝化性能的影响见图3。

图3 碳源对菌株D5反硝化性能的影响Fig.3 Effect of the carbon source on the denitrification performance of strain D5

由图3（a）可知，以酒石酸钾钠为碳源时，菌株D5还原NO3--N的效果差，去除率仅有12.7%，实验过程中无NO2--N积累〔（图3（b）〕，该结果说明D5不能有效地利用酒石酸钾钠，短程反硝化难以进行，无NO2--N积累。但是朱红旭等〔25〕以酒石酸钾钠为碳源时，筛选出的反硝化菌株在72 h时NO3--N去除率超过60%，并有一定的NO2--N积累。以往的一些资料也发现不同的反硝化细菌对碳源的利用能力存在差异〔26-27〕，因此针对不同的细菌选择合适的碳源是取得好的PD效果的关键。

当以乙酸钠跟柠檬酸钠为碳源时，菌株D5均表现出强的NO3--N还原能力，但仍存在一定差异〔图3（a）〕。以乙酸钠为碳源时，24 h内NO3--N去除率较低，仅有23.8%，之后快速升高，36 h的去除率为81.1%，实验结束时，去除率达到97.9%。实验过程中PD现象明显，但是在12 h内无NO2--N积累，结合前面的NO3--N去除率，可以判断在该实验阶段D5处于适应期，NO3--N还原速率慢，无NO2--N积累。12 h之后NO2--N质量浓度逐渐升高，达到（18.29±1.61） mg/L。由以上分析可知，乙酸钠为碳源时，菌株D5可以进行PD反应，但是启动时间较长。以柠檬酸钠为碳源时，菌株D5的活性更高，24 h内NO3--N的去除率便达到90%，实验结束时去除率为94.4%，实验过程中NO2--N积累达到（18.84±2.89）mg/L，PD效果明显，启动时间短。以往很多研究曾一度将乙酸盐视为PD的最佳电子供体，Lingxiao GONG等〔12〕曾以乙酸盐作为碳源在C/N为2.5时实现了高的PD效果，Rui DU等〔28〕也以乙酸盐驱动PD实现了NAR达到90%的效果，而本实验中柠檬酸钠能更快速地启动PD，是菌株D5的最佳碳源，与以往的研究存在差异，这可能是由于反硝化系统中细菌的种类不同所致，以前也有资料发现不同的PD菌群对同一类型的碳源利用能力不同〔15，29〕，可以判断，菌株D5能更有效地利用柠檬酸钠。朱云等〔30〕同样发现乙酸钠、柠檬酸钠是好氧反硝化细菌Pseudomonas furukawaii的最佳碳源。

由上面的分析可知，柠檬酸钠和乙酸钠为碳源时，D5去除NO3--N效果好，NO2--N积累明显，而柠檬酸钠能更快速地启动PD，为菌株D5的最佳碳源。

2.3.2 C/N

C/N通常被认为是实现PD的重要因素，C/N越低，Nir受到抑制，NO3--N还原速率大于NO2--N还原速率，易造成NO2--N积累〔11，15〕，但过低的C/N会抑制反硝化细菌的活性，因此探究C/N对PD的影响对于取得稳定的NO2--N积累有着重要的意义。图4是C/N对菌株D5反硝化性能的影响。

图4 C/N对菌株D5反硝化性能的影响Fig.4 Effect of C/N on the denitrification performance of strain D5

由图4（a）可知，在不同的C/N条件下，菌株D5去除NO3--N的效果有较大的差别。当C/N为0.8、1时，实验过程中NO3--N有一定的去除，实验结束时NO3--N质量浓度分别为34.96、23.89 mg/L，去除率为59.0%、71.8%，表明体系中有机碳限制了细菌的生长，导致NO3--N去除率较低。当C/N升高为2时，NO3--N去除率明显增大，实验结束时NO3--N质量浓度为14.45 mg/L，去除率达到84%。而当C/N为3、5时，反硝化效果进一步提升，到48 h时，去除率便分别达到88.3%、90.5%，实验结束时，去除率均高于96.0%，明显高于当C/N为0.8、1、2时的NO3--N去除率，表明随着C/N越高，D5还原NO3--N的效果越好。以往的一些研究也表明，细菌的脱氮效果会随着C/N的增大而升高，达到一定值后，脱氮效果维持稳定〔31〕。本研究中C/N为3、5时，最终的NO3--N去除率接近，刘泳等〔21〕也发现当C/N大于3以后，碳源已不再是反硝化体系的限制性因素，NO3--N的去除率基本不变。而Jinming DUAN等〔32〕却发现，菌株Vibrio diabolicusSF16在C/N为10时脱氮效果最高，造成这种差异的原因可能跟碳源类型、微生物种类等因素有关。

整个实验过程中一直有明显的NO2--N积累，对比图4（a）、图4（b）发现，NO2--N的积累规律不同于NO3--N的去除规律，C/N为1、2、3时，36 h后质量浓度便分别达到（61.87±2.43）、（61.76±1.67）、（57.47±2.90） mg/L，积累率超过60%，而当C/N为0.8、实验中仍存在显著的NO2--N积累，但是积累量要低于C/N为1、2、3时，结合前面的硝酸盐去除率，推测C/N为0.8时，体系内碳源不足，Nar和Nir均被抑制，因此积累的NO2--N浓度略低。而当C/N为5时，充足碳源能够保证Nir的活性，产生的NO2--N被还原，积累量最低，但是仍有一定的积累，可以推断菌株D5的Nir活性要低于Nar活性，致使NO3--N还原速率大于NO2--N还原速率，易于积累NO2--N。

由上面的分析可知，合适的C/N是取得最佳PD效果的关键，结合硝酸盐去除率以及NO2--N的积累，本研究中的最佳C/N为3。以往的研究也表明，在一定范围内增加C/N有助于NO2--N的积累，但C/N过高反而不利，T.V.KRISHNA MOHAN等〔33〕研究了乙酸钠作为碳源时C/N对高浓度硝酸盐废水反硝化的影响，发现当C/N为1.5～3.0，完全脱氮时间和最大NO2--N积累量随C/N比的增大而增大。柳全龙等〔11〕发现在PD过程中，C/N对亚硝酸盐积累有明显的影响，当C/N在2.0～2.5时，NO2--N积累率随C/N的升高而升高，在C/N=2.5时，达到最高值82.18%，而C/N在3.3～5.0时NO2--N积累明显下降，与本实验的结果类似。不同研究中的最佳C/N存在差异，这可能跟细菌类型、碳源种类以及其他环境条件有关。

2.3.3 温度

温度可以通过影响细菌的生长和新陈代谢而影响细菌的反硝化性能，进而影响NO2--N的积累〔13〕。温度对菌株D5反硝化性能的影响见图5。

图5 温度对菌株D5反硝化性能的影响Fig.5 Effect of the temperature on the denitrification performance of strain D5

由图5可知，当温度为15 ℃时，NO3--N去除率低于10%，且无NO2--N检出，这说明15 ℃时，D5活性低下，难以还原NO3--N，无NO2--N积累。当温度上升到25 ℃和30 ℃时，NO3--N去除率明显提高，去除率均达到95%以上，实验过程中积累的NO2--N从24 h开始迅速增长，实验结束时分别达到88.14、76.7 mg/L，积累率分别高达84%、73%，获得了好的PD效果。先前的研究亦表明反硝化细菌的最适温度为20～35 ℃〔34〕。

结合前面的分析可以推断，菌株D5是一类可以同时还原NO3--N和NO2--N的反硝化细菌，Nar在跟Nir竞争中占据主导地位，NO3--N的还原速率要高于NO2--N的还原速率，引起NO2--N的积累，通过调控环境条件可以取得最佳的PD效果。

3 结论

1）从水稻田土壤中筛选出一株具有高效PD性能的菌株D5，根据形态学观察为杆状菌，结合16S rDNR测序及系统发育树比对鉴定为肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）。

2）乙酸钠和柠檬酸钠均可作为菌株D5的碳源使用。以乙酸钠为碳源时，NO2--N显著积累，但PD启动较慢，柠檬酸钠能快速启动PD反应，24 h内NO3--N的去除率便达到90%，实验过程中NO2--N达到（18.84±2.89） mg/L，是菌株D5启动短程反硝化的最佳碳源。

3）C/N对菌株D5的PD效果影响明显，最佳C/N为3，此时NO3--N的去除率高于96%，亚硝酸盐的积累量达到（57.47±2.90） mg/L，积累率超过60%。

4）温度对菌株D5的PD效果影响明显，当温度为25 ℃和30 ℃时，NO3--N去除率均达到95%以上，NO2--N积累率达到84%和73%，PD效果显著。

上述成果不但为PD/A新型脱氮工艺提供了适合的菌株，同时为确定最佳PD条件提供了重要理论支撑，在污水脱氮处理中具有广阔的应用前景。