口服制剂防治鸭浆膜炎的临床效果

高航，柴贝贝，张春杰，张丽媛

郑州赛科药业科技有限公司，郑州 450000

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer)引起的1 种接触性传染性疾病，又称为鸭传染性浆膜炎、鸭疫综合症等[1]。多发于1～6 周龄的小鸭，发病率可达90%，若不及时控制，死亡率可达80%。该病的主要症状有急性或慢性败血症、鼻分泌物增多、咳喘、下痢、头颈震颤，少数慢性病例出现头颈歪斜等症状，会形成较明显的“泪痕”，且大多生长缓慢形成“僵鸭”[2]。剖检主要有纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、关节炎等症状，常引起小鸭的大批发病和死亡，目前已成为危害肉鸭养殖业的一种最常见细菌病[3]，并且不仅感染鸭类，鹅、火鸡等禽类也可感染发病[4]。

该病的控制难点在于鸭疫里默氏杆菌的血清型较多，目前较认同的有25 种，不同时期、不同地区、不同场址的主要流行血清型都有所不同，并且在同一鸭场，甚至是同一批鸭群也可能同时存在多个血清型，且不同血清型之间的交叉保护性较低，而且难以净化，较为有效的方法是分离流行菌株进行疫苗研制，疫苗的抗原血清型与养殖中流行菌株的血清型最大程度吻合，才能保证免疫效果最佳[5]。防治该病最根本的是做好预防工作，加强鸭场的饲养管理，改善卫生条件，减少鸭群应激，建立完善的防疫和消毒制度[6]；在上述情况满足的条件下合理进行疫苗免疫，合理用药，综合防治，有效减少鸭群的发病和死亡[7]。

河南周口的鸭场在2023 年3–4 月阶段性暴发该病，发病率33.43%，死亡率11.12%，瘫痪率23.57%，损失严重，通过临床症状和剖检症状初步判定为鸭疫里默氏杆菌病，然后进行实验室诊断，确诊为鸭疫里默氏杆菌引起的鸭疫里默氏杆菌病。通过对发病鸭群进行中西药结合治疗，延缓了病情发展，同时采集病料进行鸭浆膜炎口服制剂的制备，通过灌服或饮水饲喂后，疾病得到明显地控制，死亡率和瘫痪率显著下降。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）样品来源：河南周口某鸭场发病死亡鸭3 只（3～4周龄）。

2）试验鸭来源：河南周口某鸭场樱桃谷鸭，4 周龄、6周龄SPF雏鸭各9只，2周龄SPF雏鸭39只。

3）试剂与培养基：无菌蒸馏水、无菌生理盐水、甲醛、胎牛血清、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、市售蜂胶、95%乙醇。

4）仪器与工具：MD30-B 显微镜（江南）、WJ-160A 二氧化碳恒温培养箱（上海诵诚）、XFS-280 高压灭菌锅（浙江新丰）、低温离心机（Sigma）、SHA-C恒温摇床（常州普天司）、锥形瓶、250 mL 和500 mL灭菌疫苗瓶、移液器、剪刀、镊子。

2.2 方 法

1）剖检：将病鸭置于无菌托盘，腹部向上，使用灭菌后的剪刀剖开腹腔，检查腹腔与内脏情况。

2）菌株纯化：将3株保藏菌株进行活化，分别抽取200 μL 保藏菌液加入含5%胎牛血清的TSB 中，37 ℃的恒温摇床培养24 h 后，接种于含有5%胎牛血清的TSA，并于37 ℃二氧化碳恒温培养箱中培养24 h，观察是否有污染，并挑取单个菌落镜检。将挑取的单个菌落在37 ℃的恒温摇床中培养48 h，进行扩大培养后备用。

3）蜂胶提纯：将市售蜂胶放置4 ℃储存，用时取出，及时粉碎后过筛，按照重量比1:2 加入95%乙醇，室温浸泡24～48 h，浸泡期间可以超声，增加溶解，浸泡后4 ℃ 8 000 r/min 离心取上清，用无菌纱布过滤，得到清澈透明的纯净蜂胶浸液。

4）口服制剂的制备：将扩大培养后的3 种菌液培养至浓度为109cfu/mL 时加入0.2%甲醛进行灭活，继续37 ℃恒温培养12 h 后取100 μL 涂板鉴定菌液是否完全灭活。将灭活后的菌液进行离心，留下菌体沉淀备用。将所有菌体用无菌生理盐水重悬后混匀，然后缓慢加入已处理好的蜂胶液，边加边混匀，使蜂胶液终浓度为10 mg/mL，最后根据需求量补足无菌生理盐水。

5）口服制剂的效果验证：①无菌检测：用移液器吸取250 μL 口服制剂，分别接种于TSA，37 ℃恒温培养12 h。

②紧急接种：将制备好的口服制剂按照每只灌服或饮水300 μL应用在鸭场，同时增加鸭群日粮中的蛋白质和维生素含量，可适量配合黄芪多糖[8]，控制饮水量。

③安全性试验：分别取2、4、6周龄SPF雏鸭各9只，分3 组，每组3 只，一共9 组，按照低、中、高剂量进行灌服，即：第1、2、3 组处理分别在2 周龄饲喂200、500、1 000 μL，第4、5、6组处理分别在4周龄饲喂200、500、1 000 μL，第7、8、9 组处理分别在6 周龄饲喂200、500、1 000 μL。观察饲喂后0.5、6.0、24.0 h，是否有鸭只出现不良反应，如呕吐、拉稀、瘫痪、死亡等情况。

④免疫试验：选取60 只2 周龄SPF 雏鸭分为5组，每组12 只，分组名称为第1、2、3、4、5 组，第1 组处理为生理盐水，第2组为市售鸭浆膜炎产品组，按照说明书要求每只肌注200 μL，第3、4、5 组均为口服制剂，剂量分别为200、500、1 000 μL。免疫当天为第0 天，于免疫后7、14、24 d 鸭跖骨内侧静脉采血，分离血清检测抗体。

⑤攻毒试验：将已免疫过的5 组雏鸭每组随机选取6 只进行攻毒试验，每只肌肉注射200 μL，观察鸭只是否出现瘫痪、下痢、死亡等症状，并计算保护率。保护率=（对照组发病率－接种组发病率）/对照组发病率。

2 结果与分析

2.1 剖 检

解剖发现纤维素性心包炎、肝周炎、关节炎症状，见图1。

图1 肝周炎病变

2.2 菌株纯化

镜检没有发现杂菌污染，见图2。

图2 革兰氏阴性菌（10×100）

2.3 蜂胶提纯

称取500 g 市售蜂胶，加入1 L 95%乙醇，25 ℃浸泡48 h后，4 ℃ 8 000 r/min离心取上清，用无菌纱布过滤，最终得到0.5 g/mL 的清澈透明蜂胶液800 mL 放置4 ℃备用。

2.4 口服制剂制备

本次制备了100 g 湿菌体，采用500 mL 生理盐水重悬后，缓慢加入已处理好的蜂胶液，使蜂胶液终质量浓度为10 mg/mL，边加边混匀，最后加入无菌生理盐水，补足至40 L。

2.5 口服制剂效果验证

1）灭活检测：将涂布的TSA 平板放入培养箱37 ℃培养12 h后无菌生长，灭活检测合格。

2）安全性试验：饲喂后鸭只没有出现不良反应，偶有应激系抓取导致，待平静后恢复正常状态。

3）紧急接种：应用该口服液后3 d，鸭群临床无新增死亡鸭，发病率降低至7.3%，说明该口服制剂产生了较好的应急免疫作用。

4）免疫试验：在免疫后7、14、21 d 跖骨内侧静脉采血，分离血清检测抗体，结果采用SPASS 22.0分析。由表1 可知：该口服制剂中剂量组在第14 天就可以达到较高的抗体水平，高剂量组在第21天仍有较高的抗体水平，但考虑到成本问题，临床使用时，可以在第1天使用中剂量，即每只鸭灌服或饮水500 μL，在第21天加强免疫1次。

表1 免疫后7、14、21 d抗体含量 ng/L

5）攻毒试验：在96 h 内，第2 组和第3 组处理的保护率为60.1%，第4 组和第5 组处理的保护率为100%。

3 讨 论

鸭疫里默氏杆菌病对肉鸭行业的危害很大，在预防和治疗上虽然使用抗菌药物有一定的效果，但抗菌药物的长期使用，会导致鸭疫里默氏杆菌的耐药性增加，治疗效果不明显[9]。因此，通过增强机体对病菌的抵抗力，降低药物使用量，是预防鸭疫里默氏杆菌病及降低发病率的重要措施之一[10]。本次制备的口服制剂选择的菌株均是从该养殖场分离的，针对性强，可以改善普通疫苗血清型不同导致的保护率低的问题，更好地发挥应急免疫作用，且蜂胶免疫佐剂是1种天然产物，有研究表明，蜂胶本身无明显抗原性和过敏性，毒副作用较小[11]。作为1 种具有广谱生物活性的物质，不仅能够提高机体的特异性免疫，增强巨噬细胞的吞噬能力，而且还能增强机体的非特异性免疫，促进抗体的产生，应用蜂胶配合抗原进入机体可以增加抗体产量和保护率[12-13]，将蜂胶与抗原按比例混合接种于机体后，可以增强补体的功能，产生较多的抗体，提升血清抗体水平，是天然的免疫增效佐剂，并且具有抑菌性和更高的安全性[14]。但是市售的鸭浆膜炎产品多为注射剂，易造成鸭只的应激反应，并且鸭疫里默氏杆菌血清型较多，市售的注射剂不一定符合本场流行菌株，可能出现疫苗保护率低的问题[15]。本试验结果表明，该口服制剂中剂量组在第14天可以达到较高的抗体水平，高剂量组在第21天仍有较高的抗体水平，能够起到快速治疗和应急免疫的辅助作用。该口服制剂是针对个别养殖场的病原血清型制备，在一定程度上可以起到很好的应急免疫作用，但也存在一定的应用范围制约，因此应规范应用，不随意扩大应用范围。