饲料中谷氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸钠对鳜摄食、生长、胃肠及肝功能的影响

方揽月 许耀升 刘天骥 李洪琴 刘 匆 李 虹 翟旭亮 薛 洋沈子伟 陈拥军 罗 莉

(1. 西南大学水产学院, 西南大学淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室, 重庆 400716; 2. 四川新希望六和科技创新有限公司, 成都 610000; 3. 重庆市水产技术推广总站, 重庆 400400; 4. 中国水产科学研究院长江水产研究所西南渔业研究中心, 重庆 400400)

谷氨酸(Glutamate, Glu)和谷氨酰胺(Glutamine,Gln)是水产饲料和鱼体中含量丰富的氨基酸[1], 在蛋白质代谢过程中占重要地位, 参与动物机体中的许多重要化学反应[2]。谷氨酸钠(Monosodium Glutamate, MSG)由Glu (78%)、钠和水(22%)组成, 能增加饲料鲜味, 有诱食效果。对哺乳动物的研究发现,Glu和Gln是功能性氨基酸[3], 可以调节代谢途径和细胞信号通路[4], 提高抗氧化和免疫能力[5], 改善肠道生长发育和健康[6]; MSG可以提高日增重和饲料效率, 增加肠道绒毛高度和抗氧化能力[7]。目前, 国外针对部分养殖鱼类饲料中Glu、Gln和MSG的需求已开展研究, 如Glu在鲤(Cyprinus carpio)饲料中需求量为7.11%—8.20%[8]、Gln在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevisGünther)幼鱼饲料中的需求量为0.63%[9]、MSG在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)饲料中的适宜添加量为0.5%[10], 这3种添加剂在鳜饲料中的应用效果均未有报道。

鳜(Siniperca chuatsi)是我国特有的淡水名贵鱼类, 俗称“桂花鱼”, 属于鲈形目、鳜亚科、鳜属。其肉质细嫩, 无肌间刺, 胆固醇低, 营养价值高, 深受国内外消费者青睐, 市场需求大。目前, 我国鳜产量已增至37.4万吨, 产值超200亿元, 是最具发展潜力的养殖品种之一[11]。然而, 随着配合饲料替代幼杂鱼行动的推进, 鳜驯化转食及饲喂过程中仍存在饲料适口性、胃肠和肝功能欠佳的问题[12], 饲料配方有待优化。基于此, 本实验在鳜饲料中添加不同含量的Glu、Gln和MSG, 探讨其对鳜生长性能,胃肠消化吸收和屏障功能, 以及肝功能等的影响差异, 为鳜饲料配方的优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验所需鳜购于重庆市潼南区名优鱼养殖基地, Glu、Gln和MSG由四川新希望畜牧科技有限公司提供。以鳜基础饲料为对照组(实测Glu含量为7.47%, 检验方法为GB/T 18246-2019酸水解法; 采用Waters ACQUITY UPLC I-CLASS超高效液相色谱进行色谱分离, 实测游离Gln含量为0.03%, LCMS法检测), 在其基础上分别添加两个浓度梯度(0.2%和0.4%)的Glu、Gln和MSG, 组成1个对照组和6个试验处理组: CON、Glu-0.2、Glu-0.4、Gln-0.2、Gln-0.4、MSG-0.2和MSG-0.4。饲料配方及营养水平见表1。饲料原料在粉碎机(四川简阳棉丰农业机械制造厂3Z-110F型)粉碎后过40目筛, 混匀机(山东慧晨机械有限公司HC-50型)混合后, 经膨化制粒机(河北邢台裕工科技开发有限公司DGP40-C型)制成3 mm的浮性饲料(膨化加工温度为150℃),经过自然风干后, -20℃冰箱保存备用。

表1 实验饲料组成及营养水平(风干基础)Tab. 1 Composition and nutrient level of test diet (air-dry basis; %)

1.2 饲养管理

实验用鳜基础饲料(CON)驯化15d后, 随机选择健康、规格整齐, 初始体质量(17.60±0.53) g的鳜分为7组, 每组3个重复, 每个重复15尾鳜, 饲养于农业农村部长江中上游渔业资源环境科学观测北碚实验站玻璃养殖缸中, 缸体规格: 长90 cm, 宽30 cm,高60 cm。每日投喂2次(8:30和18:30), 投饲量为鱼体重的3%—5%。养殖水源为曝气自来水, 在养殖期间, 每天早晚各换水80%, 水温为23—29℃, pH为6.7—7.2, 溶解氧＞7.0 mg/L, 氨氮＜0.5 mg/L, 亚硝酸盐＜0.05 mg/L, 硫 化 物 浓 度＜0.05 mg/L, 光 周 期(L∶D)为12∶12。

1.3 样品的制备与分析

样品采集在鳜养殖试验结束后饥饿24h,每组每个重复随机选取6尾鳜用适量MS-222麻醉,称重用以计算生长性能指标, 计算公式参照徐杭忠等[13]的方法。用肝素钠处理过的1 mL一次性无菌注射器在尾静脉处取血, 4500 r/min离心10min制备血浆后, 转入-80℃冰箱内保存, 用于血液指标测定。后将鳜于冰上解剖, 分离肝脏, 在肝中部同一位置取1 cm3大小的组织放入装有多聚甲醛的离心管中, 分离胃、肠, 液氮速冻后, 转入-80℃冰箱备用。每组每个重复随机选取4尾鳜在无菌条件下取肠道, 液氮速冻后, 转入-80℃冰箱保存, 用于肠道菌群的高通量分析。

常规营养成分的测定水分采用105℃烘干恒重法测定; 粗蛋白质含量采用凯式定氮法测定;粗脂肪含量采用索式抽提法测定; 粗灰分含量采用550℃马弗炉煅烧法测定。

血浆转氨酶及抗氧化指标测定谷草转氨酶(AST)活性(比色法)、谷丙转氨酶(ALT)活性(赖氏法)、总抗氧化能力(T-AOC)活性(比色法)和丙二醛(MDA)含量(TBA法), 均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定, 具体测定方法参照试剂盒说明书进行。

肝脏HE染色切片由重庆博诺恒生物科技有限公司代制。

消化酶指标测定胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

肠黏膜通透性指标测定血浆D-乳酸(Dlactate) 、内毒素 (ET)含量、二胺氧化酶(DAO)活性均采用上海优选生物科技有限公司的Elisa试剂盒测定。

肠道微生物组成由上海派诺森生物科技有限公司代测。

1.4 数据处理

实验结果用SPSS 22.0对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA), 用Duncan氏多重比较分析组间差异显著性程度, 当P＜0.05时认为差异显著。结果数据用平均值±标准差(mean±SD)表示。

2 结果

2.1 Glu、Gln和MSG对鳜生长性能及饲料利用的影响

在饲料中添加Glu、Gln和MSG后, 增重率(WGR)指标, Glu-0.2组较CON组显著升高了27.01% (P＜0.05),Gln-0.2组较CON组显著升高了21.08% (P＜0.05),MSG-0.4组较CON组显著升高了23.53% (P＜0.05),Glu-0.4、Gln-0.4、MSG-0.2较CON组差异不显著(P＞0.05); 尾均摄食量(FI)指标各实验组较CON组,分别升高了7.27%、16.53%、11.35%、8.71%、19.98%和24.41% (P＜0.05); 饲 料 转 化 率(FER)指 标, Glu-0.2和Gln-0.2组较CON组差异显著, 分别升高了11.54%和9.62% (P＜0.05) , 其他组较CON组均无显著差异(P＞0.05; 表2)。

2.2 Glu、Gln和MSG对鳜胃、肠消化吸收能力的影响

在饲料中添加Glu、Gln和MSG后, 各实验组鳜胃蛋白酶活性较CON组均显著上升(P＜0.05); Glu组和Gln-0.2组的胃H+-K+-ATP酶活性较CON组显著提高, 分别提高了46.88%、50.08%和24.48% (P＜0.05)。肠道胰蛋白酶指标, Glu-0.2组较CON组显著上升了39.35% (P＜0.05)。肠道淀粉酶活性, 各实验组均显著高于CON组(P＜0.05); Na+-K+-ATP酶活性, Glu组、Gln-0.2、MSG组较CON组显著提高了24.77%、12.84%、10.09%、11.92%和20.18% (P＜0.05; 表3)。

表3 Glu、Gln和MSG对鳜胃、肠消化吸收能力的影响Tab. 3 Effects of Glu, Gln and MSG on gastrointestinal digestion and absorption of mandarin fish (U/mgprot)

2.3 Glu、Gln和MSG对鳜肠屏障功能的影响

在饲料中添加Glu、Gln和MSG后, 各实验组鳜血浆ET、D-LA含量较CON组均显著下降(P＜0.05);Glu组、Gln-0.2组、MSG组血浆DAO活性显著低于对照组(P＜0.05; 表4)。

表4 Glu、Gln和MSG对鳜肠道屏障功能的影响Tab. 4 Effects of Glutamate family on intestinal barrier function of mandarin fish

2.4 Glu、Gln和MSG对鳜肠道微生物组成的影响

CON到MSG-0.4组共21个肠道微生物样本, 测序覆盖率均在95%以上, 测序结果可信度高。各组间的Chao1、Shannon和Simpson指数无显著性差异(P＞0.05) , 但Gln组的Chao1、Shannon指数与CON组相比均有下降趋势(表5)。物种组成方面, 门水平上优势菌群均为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes) , Glu-0.2组的软壁菌门(Tenericutes)丰度显著高于CON组, 且为所有组中最高(P＜0.05); Glu和Gln组的梭杆菌门(Fusobacteria)丰度较CON组有降低趋势, 而MSG组相反(P＞0.05; 图1) 。属水平Glu-0.2组的索氏鲸杆菌属(Cetobacterium)丰度显著高于CON组(P＜0.05; 图2)。

图1 鳜肠道菌群物种组成分布图(门水平)Fig. 1 Species distribution map of mandarin fish intestinalis(phylum level)

图2 鳜肠道菌群物种组成分布图(属水平)Fig. 2 Species distribution map of mandarin fish intestinalis(genus level)

表5 Glu、Gln和MSG对鳜肠道微生物组成的影响Tab. 5 Effects of Glutamate family on Microbiome of mandarin fish

2.5 Glu、Gln和MSG对鳜肝脏功能和组织结构的影响

血浆AST活性, Glu组与CON组差异不显著(P＞0.05), Gln组和MSG组较CON组显著升高(P＜0.05);血浆ALT活性, Glu组与CON组差异不显著(P＞0.05),Gln组和MSG组较CON组显著升高(P＜0.05; 图3)。

图3 Glu、Gln和MSG对鳜血浆转氨酶的影响Fig. 3 Effects of Glu, Gln and MSG on mandarin fish plasma aminotransferase

对鳜肝脏组织的石蜡切片进行显微观察后发现, 与CON组相比, Glu、 MSG组鳜肝细胞变化不显著, 排列相对更加紧密; Gln-0.2、Gln-0.4组鳜肝脏细胞肿胀、空泡化现象明显增多(图4)。

图4 Glu、Gln和MSG对鳜肝脏组织结构的影响Fig. 4 Effects of Glu, Gln and MSG on the liver tissue structure of mandarin fish

2.6 Glu、Gln和MSG对鳜抗氧化能力的影响

血浆T-AOC, Glu组与CON组相比无显著差异(P＞0.05), Gln组较CON组显著下降(P＜0.05), MSG-0.4组较CON组显著升高(P＜0.05); Glu组 、MSG组的血浆MDA较CON组均显著降低, Gln组较CON组均显著升高(P＜0.05; 图5)。

图5 Glu、Gln和MSG对鳜抗氧化能力的影响Fig. 5 Effects of Glu, Gln and MSG on antioxidant capacity of mandarin fish

3 讨论

3.1 Glu、Gln和MSG对鳜摄食和生长性能的调控

Glu和Gln是鱼类肠、肝、肌肉和肾脏的主要能量来源, 也是合成谷胱甘肽和 6-磷酸氨基葡萄糖的底物, 可以保护细胞免受氧化损伤, 改善肠道对营养物质的吸收能力, 有助于提高饲料转化率[14]。前人研究表明, 建鲤饲料中Glu 含量8.34%时显著提高其摄食量及增重率, 而较低含量(基础饲料5.34%)则无显著影响[8]。本实验对照组饲料中Glu含量为7.47%, 其主要存在于蛋白质, 鲜味不明显。本实验添加的Glu为游离态, 具有鲜味, 可以增加鱼饲料的风味和吸引力, 促进鱼类摄食。

Gln虽无鲜味, 但可促进肠道黏膜细胞的生长和修复, 增强肠道消化酶活力, 提高鱼类对饲料的消化吸收效率, 从而增加摄食量。在草鱼(Ctenopharyngodon idella)饲料中添加0.3%—1.2%的Gln显著提高其增重率和特定生长率, 显著降低饲料系数[15]。在本研究中Gln添加组中仅0.2 组饲料转化率提高, 其原因可能是因为饲料加工过程中的高温导致Gln分解产生毒性。

MSG是Glu的钠盐形式, 因含有Na+, 具有较强的鲜味和诱食效果, 能够直接刺激鱼类的味觉增强鱼类的摄食欲。MSG在水产动物饲料中的研究鲜见, 虹鳟饲料中的适宜添加量为0.5%[10]。本研究中MSG0.2%和0.4%两个添加水平均促进摄食并提高增重, 但FER无显著变化。

综上, 饲料中添加Glu、Gln和MSG对鳜生长均具有促进作用, Glu和Gln适量添加(0.2%)可提高饲料利用率, 0.4%属于过量添加; MSG主要起到诱食作用, 对饲料利用率影响不明显, 最佳添加水平有待进一步研究。

3.2 Glu、Gln和MSG对鳜胃肠功能的改善

肠道是鱼类消化吸收的主要场所, 也与鱼体内各种免疫、应激和新陈代谢息息相关, 因此保护肠道屏障对鱼体的生长和健康极为重要[16]。动物胃肠上皮黏膜中具有特定的Glu识别系统[17], 据报道摄入Glu可通过刺激迷走神经增强胃酸分泌[18,19]。已有研究证明Glu 和Gln均可提高草鱼肠道消化酶活性[15,20], 而MSG对鱼类消化酶是否有影响还未见研究。本实验结果表明Glu、Gln可提高鳜胃的泌酸能力, Glu、Gln和MSG均可以提升鳜胃肠消化吸收酶活力。D-LA和ET由肠道细菌产生, DAO是肠黏膜绒毛上皮层内的高活性酶, 当肠黏膜屏障功能受损时, D-LA、ET和DAO会进入血液, 导致血内浓度升高。本实验添加Glu、Gln和MSG后, 鳜血浆ET、D-LA含量和DAO活性均有所降低, 说明3种添加剂均可提高鳜肠道的屏障功能, 对肠道健康均有促进作用。综合来看, Glu的胃肠促进作用最好。

已有研究表明, 在断奶仔猪饲粮中添加Glu, 可以改善肠道菌群结构, 有利于将肠道中不可消化的多糖发酵成短链脂肪酸, 从而减少仔猪腹泻的风险[21]。本实验中Glu-0.2组属水平上显著增多的索氏鲸杆菌(Cetobacterium), 可产生多种氨基酸、合成B族维生素、通过代谢产物乙酸激活副交感神经系统, 从而促进鱼类胰岛素表达和糖利用能力, 在鱼类营养中起着重要作用[22]。Glu-0.2组能够增加肠道菌群的丰富度(Chao1), 提升潜在有益菌(Cetobacterium)丰度, 说明添加一定浓度的Glu可促进肠道内有益菌增殖, 优化鳜肠道菌群结构。Gln组Cetobacterium丰度下降且肠道菌群的Chao1、Shannon指数下降可能是因为饲料制作过程中高温膨化导致的毒性作用影响了菌群的物种数量和分布均匀度。

3.3 Glu、Gln和MSG对鳜抗氧化能力的影响

Glu是合成谷胱甘肽(GSH)的底物, 谷胱甘肽有抗氧化性, 属于机体抗氧化系统, 与T-AOC等指标密切相关, 其活性的高低直接反映着机体对于应代偿能力和清除自由基(ROS)能力的强弱[23]。脂质过氧化反应的最终产物为MDA, 其浓度反映氧化应激诱导的机体细胞损伤程度[24]。Jiang等[25]对体外培养鱼肠道细胞的研究表明, 细胞中的 GSH 浓度和抗氧化能力会随着细胞外 Glu 水平的增加而增加, 而MDA含量和细胞蛋白羰基含量则相反, 其原因是适量的体外Glu补充显著提高了肠细胞中Nrf2的表达水平, Glu通过调节抗氧化相关信号分子的表达, 起到增强鱼体抗氧化能力的作用。本实验结果说明Glu、MSG具有提高鳜机体抗氧化能力的作用, 这与Jiang等[26]在草鱼饲料中添加Gln以及王一冰等[27]在清远麻鸡饲料中添加MSG的研究一致; 而Gln则使鳜的抗氧化能力下降, 这可能与高温导致的Gln产生毒性作用有关。

3.4 Gln对鳜肝功能的负面影响

鱼类肝脏是鱼体内代谢和解毒的中心, 它具有多种生理和生化功能, 其对鱼类生长代谢和健康非常重要。在正常状态下鱼类血中氨基转移酶活性很低, 当肝脏组织受损或者功能减弱时, AST和ALT易进入血液中[28]。本实验中Gln组鳜血浆AST和ALT指标显著高于CON组, 说明添加Gln对肝脏造成了一定程度的损伤。从本实验结果来看, Gln使肝功能变差, 可能是因为饲料制作过程中的高温环境使Gln分解产生焦谷氨酸和氨[29]。焦谷氨酸被认为是一种具有潜在毒性的代谢产物, 过量堆积易导致氨基酸和蛋白质的氧化损伤, 其毒性受到暴露时间和浓度、生物体的种类和生理状态等多种因素的影响[30]; 在一些硬骨鱼体内, 部分氨在肝脏通过尿素循环排除, 而氨的积累会对鱼体的肝脏和神经系统产生毒性影响, 影响肝脏功能和健康[31]。因此, 鳜饲料不建议添加Gln, 后续研究可以选择使用Gln的最佳二肽替代物Ala-Gln[32], 其较Gln更为稳定, 不易降解产生氮, 机体内的肽键剪切二肽即可释放Gln, 生物利用度更高。

4 结论

在本实验条件下, Glu、Gln和MSG促进鳜摄食、生长、胃肠消化吸收功能和肠道物理屏障。Glu-0.2%、Gln-0.2%的促生长作用是摄食量和饲料转化率共同增加的结果, MSG则主要表现为促进摄食效果显著。Glu、MSG对鳜肝脏健康无明显影响, Gln则会使鳜肝功能下降、抗氧化能力降低、肠道微生物失调。三种添加剂相比较, Glu-0.2%对鳜的营养效应最佳, 能增强肠道物理屏障, 提高胃酸分泌和胃肠消化吸收能力, 改善肠道菌群, 促进鳜生长和饲料转化。