低温处理对段殖黄线藻生长、油脂积累、光合及抗氧化酶活性的影响

邓 仟 朱瑞鸿 高保燕 于博涵 唐子涵 张成武

(暨南大学生命科学学院生态学系, 广州 510632)

微藻凭借种类丰富、生长快速、可以积累多种活性物质及具有较强的环境适应能力, 在生物燃料、营养膳食、日用化妆和废水处理等方面的潜力不断被挖掘[1—4], 大部分微藻, 比如普通小球藻(Chlorella vulgaris)、富油新绿藻(Neochloris oleoabundans)、雨 生 红 球 藻(Haematococcus pluvislis)、微拟球藻(Nannochloropsissp.)[5—8]等都被证实是植物蛋白、色素、脂质、脂肪酸及碳水化合物的自然生物来源。段殖黄线藻(Xanthonema hormidioides)是黄藻纲中一类多细胞的丝状微藻, 在一定条件下可积累大量油脂以及单不饱和脂肪酸(棕榈油酸)、多不饱和脂肪酸(二十碳五烯酸)、类胡萝卜素和金藻昆布多糖, 且因为易于采收和大规模培养逐渐受到关注[9,10]。近年来, 丝状微藻工业化研究和应用愈发成熟, 比如螺旋藻在营养保健、食品及水产养殖行业中备受青睐[11]; 小黄丝藻(Tribonema minus)具有较高的棕榈油酸含量(20.72% DW)和生产效率(90.88 mg/L/d), 经浓缩分离后棕榈油酸含量可达到80.11%[12]; Wang等[13]对6种黄丝藻进行研究, 其中同形黄丝藻(Tribonema aequale)金藻昆布多糖含量最高可达干重的17.20%, 从中分离的金藻昆布多糖能够促进小鼠巨噬细胞中细胞因子和NO的释放, 并发挥免疫调节作用; 另外, 在饲料中添加5%的黄丝藻(Tribonemasp.)作为膳食补充剂可以提高金鲳(Trachinotus ovatus)的生长性能和抗氧化能力, 通过上调非特异性免疫相关基因和抗炎细胞因子的表达还能增强其免疫力, 促进肝脏健康[14]。

温度作为重要的环境因子对微藻的生长和发育起着关键作用。越来越多的研究表明, 低温有利于增加脂肪酸的多不饱和度、促进胞内油脂、色素及冷适应酶和特殊蛋白质的合成。Wei等[15]通过降低培养温度, 使亚心形四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)和眼点拟纳绿球藻(Nannochloropsis oculata)多不饱和脂肪酸(PUFAs)的比例显著升高(P＜0.05)。生长在寒冷环境下的绿藻可以产生高水平的虾青素、花青素、玉米黄素和总胡萝卜素等光保护色素来应对低温引起的ROS过度积累[16]。许多应用于商业和工业上重要的酶, 包括淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶, 以及近年来在医药、化妆品和食品领域需求激增的抗冻蛋白都来源于冷适应微生物或藻类[17,18]。文献报道黄线藻属(Xanthonema)是典型的嗜冷或适冷型微藻, 广泛分布于南极地区或高山土壤[19], 本实验室的前期研究发现段殖黄线藻是一种典型的适冷型微藻, 为了更好地适应低温, 会通过上调核糖体、磷脂酰肌醇信号系统及抗氧化系统和冷休克蛋白(CSPs)等相关蛋白来维持细胞的正常生长和代谢[10]。这也证实了在面对低温胁迫时, 微藻不仅要平衡光合作用过程中的能量流, 还需要完整的抗氧化系统和保护机制来抵抗低温所带来的氧化损伤[20]。

除了温度, 营养元素的种类和含量对微藻的生物质生产和生物活性代谢产物的积累也存在密切关系, 微藻可以利用的无机营养元素近30多种[21],其中氮在众多营养因子中的作用最为显著, 氮胁迫也逐渐成为调节微藻生化组成最突出的技术。在一些产油微藻普通小球藻、栅藻(Scenedesmussp.)、微拟球藻、梭形筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)等生产生物柴油[22,23]及通过氮胁迫增加微藻细胞内重要脂肪酸等方面的研究逐渐受到关注[24,25]。但由于微藻在培养过程中对环境的要求、污染物的控制、生物质的采收及胞内重要化合物的提取等相关生产难度和成本, 不断阻碍了微藻的商业化进程, 期望通过筛选最佳的培养藻株和最大限度地提高生产率能够突破生产瓶颈。因此, 本研究选择了具备多种优势和竞争力的段殖黄线藻作为实验材料, 探究温度和氮浓度两种关键因子的联合作用, 通过对比低温预处理和常温条件下培养的初始藻种在不同培养条件下藻细胞的生长状况、油脂、蛋白质、总碳水化合物积累及脂肪酸组成等生化指标,了解两种温度处理下的初始藻种和两种氮浓度条件下段殖黄线藻的光合活性和抗氧化酶系统对低温的响应, 同时为藻类更好的适应低温提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

以段殖黄线藻为实验材料, 该藻株来自Culture Collection of Algae at Gottingen University (SAG),现保藏于暨南大学生态学系微藻生物资源与生物技术实验室。

1.2 实验方法

实验设计 将扩培后的部分常温藻种放入5℃水槽中进行低温预处理, 适应1个月后与常温条件下培养的藻种同时进行对比实验。取处于对数生长期的低温预处理藻种和常温下培养的藻种沉降后分别接种于Φ6 cm×65 cm的柱状光生物反应器中, 初始接种浓度为(0.3±0.1) g/L, 采用以尿素作为氮源的改良Endo培养基[26], 初始氮浓度为3与18 mmol/L(后文单位简写为mmol/L), 单组设置2个平行。通入含有1%CO2(体积比)的压缩空气, 光强设置为300 μmol/(m2·s), 保持24h的荧光灯持续光照。分别设置5个温度梯度, 即5℃、10℃、15℃、20℃和25℃, 培养周期为24d。

藻细胞形态观察分别取对数生长期低温预处理和常温条件下培养的藻种以及培养24d时两种不同氮浓度的藻液, 在光学显微镜下观察并拍照记录藻细胞的细胞形态变化。

生物量测定使用差量法对生物量进行测定。将孔径为0.45 μm的滤膜预先置于105℃烘箱烘至恒重, 记为W0(g)。每隔24h收取10 mL藻液, 使用循环水式真空泵进行真空抽滤, 将带有藻细胞的滤膜再放置烘箱烘至恒重, 记为W1(g)。生物量DW(g/L)＝(W1-W0)×100。

藻粉制备在培养过程中, 每隔3天收集一定量的藻泥进行沉降, 去除上清后将藻泥转移至塑料小瓶中, 放置在-20℃冰箱中保存, 之后使用冷冻干燥机进行冻干后避光保存于4℃冰箱中。

总脂含量的测定采用Khozin-Goldberg等[27]方法加以改良, 取80—100 mg冻干藻粉(m0)置于10 mL玻璃离心管中, 放入磁力转子, 加入2 mL二甲基亚砜-甲醇混合溶液(v∶v=1∶9), 于50℃恒温磁力搅拌器中水浴3h后, 在3000 r/min下离心5min, 上清转移至干净干燥的玻璃小瓶中。再向离心管中加入4 mL乙醚-正己烷(v∶v=1∶1)混合溶液, 冰浴2h, 再次离心并将上清液至相同玻璃小瓶, 重复上述步骤直至玻璃离心管内藻渣变为灰白色。向上述离心收集的上清液中加入4 mL超纯水, 震荡后静置分层过夜。将上层有机相转移至另一小玻璃瓶中, 用氮气吹干浓缩, 再用乙醚溶解后转移至预先称重的2 mL塑料离心管中, 记m1。吹干至恒重, 记m2。计算干藻粉中总脂的含量。

脂肪酸含量测定采用Cohen等[28]方法加以改进。称取25 mg冻干藻粉, 置于15 mL螺口玻璃离心管中, 放入磁力转子, 加入2 mL含有的2%硫酸的无水甲醇-甲苯(体积比为1∶1)混合液, 再加入100 μL 0.25%的十九烷酸作为内标, 充入惰性气体氩气后密封。放置80℃水浴锅中恒温搅拌1.5h进行脂肪酸甲酯化, 冷却至常温后加入1 mL正己烷和去离子水, 混匀后在3500 r/min下离心5min。取200 μL上层有机相转移至气相色谱样品瓶, 利用高效气相色谱分析仪测定藻细胞中脂肪酸组成和含量。

叶绿素及相关荧光参数测定参考Beecraft等[29]方 法, 取1 mL样 品 置 于 样 品 杯 中, 暗 适 应15min后, 使用脉冲振幅调制叶绿素浮游植物荧光仪(Phyto-PAM), 于32 μmol/(m2·s)光强下测得叶绿素a含量(Chl.a) ; 并于2 μmol/(m2·s)光强下测定最大荧光产量(Fm)和最小荧光产量(Fo)[30]。测定快速光响应曲线(RLCs), 将测定的光照强度设置16个点,每个点光照时间为20s。结束后得到光能利用效率的初始斜率(α)、最大光合成速率, 即最大电子传输速率(rETRmax)和半饱和光强(Ik), 采用最小二乘法拟合快速光响应曲线, 拟合的模型为 Platt模型[119]。

式中, 光合速率即相对电子传递速率(rETR);Ps为光抑制时最大潜在相对电子传递速率, 即 rETRmax;PAR为光照强度;α为P-I曲线的初始斜率(Alpha);β为光抑制参数。

抗氧化酶活性及丙二醛含量的测定分别采用超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(A001-3 WST-1法)、过氧化氢酶(CAT)测试盒(A007-1 可见光法)及丙二醛(MDA)测试盒(A003-1 TBA法)对SOD、CAT活性及 MDA含量进行测定。

数据分析使用Excel 2022、Origin 2023及SPSS 25对数据进行处理、作图及差异显著性分析,以P＜0.05代表差异显著,P＜0.05代表差异极显著。

2 结果

2.1 段殖黄线藻细胞的形态学观察

取5℃低温预处理和常温下对数生长期生长的段殖黄线藻在不同氮浓度下培养第24天的藻液, 在光学显微镜下观察, 如图1所示, 段殖黄线藻大多为单列不分支的丝状体, 藻丝体通常是直的, 但也可以稍微弯曲或在中间形成凸起, 颜色主要表现为浅至亮绿色。与常温下培养的藻细胞(图1A)相比, 经过低温预处理后的段殖黄线藻(图1B)藻丝比较脆弱、长度更短, 容易断裂成碎片, 甚至可能变成单个细胞, 但藻体颜色更亮, 细胞更加“肥大”。此外,在20℃、光照强度为300 μmol/(m2·s)条件下培养24d, 初始氮浓度为3 mmol/L的藻细胞(图1D)相对18 mmol/L氮浓度的藻细胞(图1C)体积更大, 藻细胞内能明显看到许多油滴。

图1 段殖黄线藻显微镜照片Fig. 1 Microscopic photo of Xanthonema hormidioides

2.2 不同温度、氮浓度及藻种培养方式对段殖黄线藻生长的影响

经低温(5℃)预处理和常温(25℃)条件下培养的段殖黄线藻初始藻种在不同温度下的生长状况存在明显差异(图2)。在5℃、10℃和15℃条件下,18 mmol/L初始氮浓度的低温预处理段殖黄线藻生物量均高于常温实验组, 其中15℃时, 低温预处理段殖黄线藻生物量最高可达10.1 g/L, 常温段殖黄线藻则为8.74 g/L。尤其在5℃, 两种氮浓度下的常温段殖黄线藻基本不生长, 低温预处理的段殖黄线藻可以达到2.2 g/L, 表明常温段殖黄线藻还未能适应骤然的低温胁迫, 且对氮的利用程度较低。而在20℃和25℃条件下, 低温预处理段殖黄线藻与常温实验组生长曲线大体一致, 即使在较高的温度下低温预处理后的段殖黄线藻依然能够维持自身的生物量积累。对比两种不同的初始氮浓度, 随着温度升高, 两种段殖黄线藻的生物量积累均呈现先上升后下降的趋势。其中低温预处理段殖黄线藻在高氮浓度下可达到最大生物量积累, 最高生物量依次为15℃＞20℃＞10℃＞25℃＞5℃, 分别为10.1、8.7、8.0、5.9和2.2 g/L, 而常温段殖黄线藻达到最大生物量依次是20℃＞15℃＞10℃＞25℃＞5℃, 分别为9.4、8.7、7.2、6.2和0.7 g/L。

图2 不同温度和初始氮浓度对低温和常温处理段殖黄线藻生长的影响Fig. 2 Effects of different temperatures and initial nitrogen concentrations on the growth of Xanthonema hormidioides under low and normal temperature treatments

2.3 不同温度、氮浓度及藻种培养方式对段殖黄线藻油脂积累的影响

段殖黄线藻细胞油脂积累对氮胁迫的响应较为明显, 初始氮浓度为3 mmol/L的油脂积累量在各温度下均高于18 mmol/L实验组(图3), 且在25℃培养第12天时, 初始氮浓度为3 mmol/L的常温段殖黄线藻高出18 mmol/L的油脂含量近40%。在同一温度下, 随着培养天数的增加藻细胞内脂质含量会随之增加, 培养后期均能维持较高的油脂含量(5℃除外)。在5—25℃内, 油脂积累情况总体呈现先上升后下降的趋势, 各温度最佳油脂积累情况为20℃＞15℃＞25℃＞10℃＞5℃, 分别占干重的64.20%、57.11%、52.03%、48.40%和39.45%。培养温度为5℃时, 常温预处理段殖黄线藻胞内油脂积累显著降低。但是在较高温度下, 低温预处理后的段殖黄线藻的油脂积累反而要高于常温实验组。由此可知, 经过低温预处理后的段殖黄线藻在油脂生产方面的能力得到了有效的提升。

图3 不同温度和初始氮浓度对低温和常温处理段殖黄线藻油脂积累的影响Fig. 3 Effects of different temperatures and initial nitrogen concentrations on lipid accumulation in Xanthonema hormidioides under low and normal temperature treatments

2.4 不同温度、氮浓度及藻种培养方式对段殖黄线藻蛋白和碳水化合物的影响

培养基中氮含量是影响藻细胞内蛋白质积累的关键因素。由图4可知, 初始氮浓度越高, 段殖黄线藻胞内蛋白质含量越高, 但随着培养时间的延长,胞内总蛋白含量逐渐减少。段殖黄线藻蛋白质积累的最佳温度为15℃, 在培养初期总蛋白质含量能达到细胞干重的35%以上, 第12天最高可达43.5%(18 mmol/L)。此外由图5可知, 温度变化对段殖黄线藻细胞内总碳水化合物含量的影响较小, 总体占细胞干重的10%—25%。而在15℃和20℃时, 培养后期的总碳水化合物含量会有所降低, 低温预处理后的段殖黄线藻表现更为明显。

图4 不同温度和初始氮浓度对低温和常温处理段殖黄线藻蛋白质含量的影响Fig. 4 Effects of different temperatures and initial nitrogen concentrations on protein content of Xanthonema hormidioides under low and normal temperature treatments

图5 不同温度和初始氮浓度对低温和常温处理段殖黄线藻总碳水化合物含量的影响Fig. 5 Effects of different temperatures and initial nitrogen concentrations on total carbohydrate content of Xanthonema hormidioides under low and normal temperature treatments

2.5 不同温度、氮浓度及藻种培养方式对段殖黄线藻的脂肪酸组成和含量的影响

段殖黄线藻细胞内脂肪酸主要由单不饱和脂肪酸, 如棕榈油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1); 饱和脂肪酸包 括 肉 豆 蔻 酸(C14∶0)、棕 榈 酸(C16∶0)、硬 脂 酸(C18∶0); 以及少量的多不饱和脂肪酸, 如二十碳五烯酸(C20∶5)、亚油酸(C18∶2)组成。由图6A可知, 段殖黄线藻中棕榈油酸占绝大部分, 最高可达细胞干重的27.8% (20℃、3 mmol/L), 其次是棕榈酸。二十碳五烯酸(EPA)大约占干重的2.0%左右。低温预处理和常温段殖黄线藻最佳脂肪酸积累温度均为20℃, 分别占干重的49.05%和42.09%。当温度上升至25℃时, 藻细胞内脂肪酸含量呈现下降的趋势,这与段殖黄线藻油脂积累规律基本一致。本研究还发现, 经过低温预处理后的段殖黄线藻在积累棕榈油酸、油酸、肉豆蔻酸及棕榈酸方面具有明显优势。对饱和、单不饱和及多不饱和脂肪酸相对含量进行分析(图6B), 段殖黄线藻中单不饱和脂肪酸占总脂肪酸的绝大部分, 约50%—60%, 饱和脂肪酸则接近30%左右, 而18 mmol/L初始氮浓度的段殖黄线藻相比于3 mmol/L更加有利于段殖黄线藻多不饱和脂肪酸的积累。图6C不同类别脂肪酸绝对含量百分比显示, 在5℃、10℃、20℃和25℃条件下, 低温预处理段殖黄线藻中的单不饱和脂肪酸以及多不饱和脂肪酸含量均高于常温段殖黄线藻。因此可以得知, 经过低温预处理后的段殖黄线藻对于高价值脂肪酸的生产更具优势。

2.6 低温胁迫对段殖黄线藻光合活性的影响

叶绿素荧光分析技术是一种研究植物光合生理状况以及反应逆境胁迫对机体产生影响的快速、灵敏的测定和诊断技术[31]。图7中列举了段殖黄线藻在低温(5℃)下两种不同预处理藻种和不同初始氮浓度下的相关光合参数。由图7A可知, 经过低温预处理的段殖黄线藻在5℃下叶绿素a的含量随着培养时间的延长不断增加, 第15天时在初始氮浓度为3 和18 mmol/L条件下的叶绿素a含量分别为9.98和8.91 mg/g。而常温段殖黄线藻的叶绿素a含量随培养天数的增加呈现先下降后升高的趋势,第9天时最低, 为6.59 mg/g (18 mmol/L), 表明低温胁迫对常温段殖黄线藻细胞叶绿素a的积累产生了明显的抑制作用。图7B和7C分别表示两种段殖黄线藻在光合系统II中最大光能转化效率(Fv/Fm)和潜在光合活性(Fv/Fo)对低温的响应, 其中Fv/Fm在0.65—0.75,Fv/Fo在2—3。在接种初期, 低温预处理段殖黄线藻的Fv/Fm和Fv/Fo均小于常温段殖黄线藻, 但到了培养后期, 常温段殖黄线藻的光合电子传递速率受到抑制,Fv/Fm和Fv/Fo不断减小, 最终低于低温预处理后的段殖黄线藻。

图7 低温(5℃)对段殖黄线藻光合活性的影响Fig. 7 Effect of low temperature (5℃) on the photosynthetic activity of Xanthonema hormidioides

α为光响应曲线的初始斜率, 表示微藻对光能的利用率。由图7D可见, 在5℃培养前6d, 常温段殖黄线藻的α值均大于低温预处理段殖黄线藻, 第9天后α值呈现下降趋势, 低温预处理段殖黄线藻的光能利用率逐渐超过常温实验组。图7E中ETRmax代表段殖黄线藻在培养15天内的最大电子传递速率, 第3天时常温段殖黄线藻的ETRmax是低温预处理黄线藻的2倍(18 mmol/L), 但是培养至12天时, 低温预处理段殖黄线藻最大电子传递速率不断升高,在第15天时相比于常温段殖黄线藻增长了45.3%(3 mmol/L)和9% (18 mmol/L)。根据图7F IK值变化趋势可知, 低温预处理后段殖黄线藻对强光的耐受力随着培养时间的延长同样会反超常温段殖黄线藻。综上表明, 低温预处理后的段殖黄线藻在5℃的低温胁迫下光合响应机制要明显优于常温段殖黄线藻。

2.7 低温对段殖黄线藻抗氧化酶活性的影响

丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化的重要生物指示物, 通常由过量的活性氧(ROS)所引起[32], 因此可以根据MDA的含量推测出ROS对细胞膜的损害程度。本研究分别对比了低温预处理后不同初始氮浓度(3和18 mmol/L)及与常温预处理(18 mmol/L)段殖黄线藻在5℃下的MDA含量, 并进行差异显著性分析。如图8A所示, 培养15d内, 低温预处理后初始氮浓度为18 mmol/L的MDA含量均显著高于3 mmol/L实验组(P＜0.05), 较高的氮浓度在一定程度上促进了MDA的合成。对比两种不同温度处理的段殖黄线藻, 低温预处理最大值出现在第12天,为0.47 nmol/mg protein, 常温段殖黄线藻则在第15天达到最高含量0.49 nmol/mg protein, 培养后期低温和常温预处理段殖黄线藻之间存在极显著差异(P＜0.05)。

图8 低温(5℃)对段殖黄线藻MAD、SOD、CAT活性的影响Fig. 8 Effect of low temperature (5℃) on the activities of MAD, SOD, and CAT in Xanthonema hormidioides

超氧化物歧化酶(SOD)是植物体内重要的抗氧化酶, 具有清除生物体内超氧阴离子自由基的功能,保护机体免受自由基的伤害[33]。由图8B可知, 不同初始氮浓度和不同温度处理的段殖黄线藻细胞内SOD活性的变化趋势基本一致, 总体呈现先上升后下降的趋势,在培养前期差异不显著, 但在第12天之后3 mmol/L初始氮浓度的实验组要显著高于18 mmol/L (P＜0.05)。对比两种不同温度预处理间SOD活性发现, 低温预处理段殖黄线藻要显著高于常温处理段殖黄线藻(P＜0.05), 两者均在第5天时达到最高值, 分别为65.6和52.0 U/mg protein。综上表明, 无论是5℃的低温胁迫或是培养后期的氮胁迫,藻细胞内SOD活性均会显著提升, 低温预处理后的段殖黄线藻更有利于SOD活性的增强, 以此促进细胞内多余活性氧的清除。

过氧化氢酶(CAT)也是植物体内极为重要的逆境生理酶, 可以通过清除线粒体电子传递、β-脂肪酸氧化及光呼吸等过程中产生的过氧化氢(H2O2)来防止植物体受到活性氧自由基的伤害[34]。根据图8C两种不同氮浓度之间的活性分析, 培养前期,较低的初始氮浓度会促进CAT活性的增强, 第3天可以达到最高值0.64 U/mg protein, 将近18 mmol/L初始氮浓度的3倍。而随着培养时间的延长, 3 mmol/L氮浓度组的段殖黄线藻CAT活性不断降低, 并显著低于18 mmol/L初始氮浓度组(P＜0.05)。此外, 低温预处理实验组CAT活性明显高于常温段殖黄线藻, 第5天活性最大值为0.56 U/mg protein, 是常温段殖黄线藻的2倍, 培养后期两者均表现为差异极显著(P＜0.01)。

3 讨论

3.1 温度对段殖黄线藻生长和胞内油脂及脂肪酸积累的影响

温度是影响微藻生长、光合作用活性、维持所有代谢过程最关键的环境因素之一。通常, 过高或过低的温度会大大限制微藻的生长、抑制光系统活性、降低营养元素的利用效率及对酶的活性产生影响[35,36]。本文首先探究了5种培养温度及两种温度预处理段殖黄线藻生物量积累的影响, 发现其最适生长温度为15—20℃, 更低或更高的培养温度均会抑制段殖黄线藻的生物量积累。对比两种温度预处理下的段殖黄线藻生长状态, 在10℃和15℃时, 低温预处理段殖黄线藻相比常温组生物量分别提升了10.2%和16.0%, 而在5℃时, 常温实验组藻细胞几乎不生长, 低温组则可达到2.2 g/L。这表明经过5℃低温预处理后的段殖黄线藻对温度的适应能力明显增强。

与生物量积累规律类似, 段殖黄线藻细胞内油脂和总脂肪酸的积累量随培养温度的升高均呈现先上升后下降的趋势, 最佳油脂和脂肪酸积累情况为20℃＞15℃＞25℃＞10℃＞5℃, 尤其在20℃和15℃培养后期, 段殖黄线藻总脂含量均可达到干重的50%, 甚至是60%以上(3 mmol/L)。研究还表明低温可以促进微藻合成更多的PUFAs, 高温则使SFAs的比例增加[37], 这在微拟球藻和真眼点藻(Eustigmatossp.)中都得到了证实[38,39]。本研究对段殖黄线藻不同温度下SFAs、MUFA、PUFAs的相对含量进行分析也得到了相同规律。另外, 在5℃和20℃时, 低温预处理组占干重的总脂含量分别超出常温实验组19.0%和12.2% (第21天、3 mmol/L); 在15℃时, 单不饱和脂肪酸绝对含量提升幅度达到16.5% (第24天、3 mmol/L); 10℃时, 多不饱和脂肪酸绝对含量提升幅度达到24.5%。以上表明, 经过低温预处理后的段殖黄线藻在相同条件下更加有利于胞内油脂和不饱和脂肪酸的积累。

3.2 初始氮浓度对段殖黄线藻生长和胞内主要生化组分积累的影响

在众多营养因子中, 氮对微藻生物量积累、光合活性及蛋白质、脂质和碳水化合物的合成具有明显的调控作用[22]。在最佳生长温度15℃时, 18 mmol/L初始氮浓度的段殖黄线藻生物量积累分别超出3 mmol/L 4.91 g/L (低温预处理组)和3.64 g/L(常温处理组), 最高的蛋白质和总碳水化合物积累也在高氮情况下获得, 分别占干重的43.5% (15℃、第12天)和27.1% (25℃、第12天)。相反, 低氮组的油脂积累量则均高于18 mmol/L实验组, 尤其在培养中期, 氮胁迫下段殖黄线藻的油脂含量提升了2—3倍, 最高可占干重的64.20% (20℃、第24天)。这是因为在氮充足的情况下, 会增加微藻的光合速率、促进蛋白质的合成, 使碳固定速率和氮同化速率之间形成代谢平衡, 从而减少代谢中所产生的通量转向储存脂质、三酰甘油(TAG)的生物合成[40,41]。

3.3 低温胁迫对段殖黄线藻光合活性的影响

产氧光合作用是植物、藻类等光合自养生物有效捕获光能产生化学能将二氧化碳固定转化为有机分子和生物质的过程[42]。光能的吸收、传递和转化依赖生物体类囊体膜上的光系统Ⅰ (PSⅠ)和光系统Ⅱ(PSⅡ)所驱动, 它们是由色素和蛋白质组成的复合物。植物的光合效率通常会根据环境条件的变化而发生改变, 比如低温、高温、过度辐照、干旱或有毒物质都会导致叶绿素a荧光的减少[43],但是光合生物中的光合电子传递链具有多种适应性和适应机制。比如, Roos等[44]研究就报道了一种南极蓝藻黑紫席藻(Phormidium murryi)在低温、紫外线或者是高光合辐射水平下, 会显著增加类胡萝卜素/叶绿素a的比值来减小PSⅡ的功能大小以适应外界低温。Gao等[14]通过蛋白质组学分析, 段殖黄线藻在低温下会使光合作用相关蛋白下调, 以此保护光合系统免受损伤。本研究将低温和常温预处理的段殖黄线藻藻种置于低温5℃下培养, 前9d内, 常温实验组叶绿素a含量从8.73下降至6.59 mg/g(18 mmol/L),Fv/Fm、Fv/Fo及ETRmax值均有所降低,证实了段殖黄线藻在面对低温胁迫时通过减少叶绿素含量以降低光合速率的适应策略。相反, 经过低温预处理后的段殖黄线藻无论是叶绿素a含量,还是Fv/Fm、Fv/Fo、ETRmax和IK值均在培养12d内随着时间的延长总体呈现上升趋势, 可见低温胁迫并未影响低温预处理后段殖黄线藻正常的光合作用, 反而在一定程度上增强了它的最大电子传递速率和对强光的耐受能力。

3.4 低温胁迫对段殖黄线藻抗氧化酶活性的影响

强大的抗氧化系统对微藻清除活性氧的氧化损伤至关重要。当细胞代谢过程遇到病害生物、强光和低温等各种生物或物理胁迫时, 高水平的活性氧(ROS)便会与细胞内某些生物分子进行反应,改变或使其失去生物化学活性, 破坏机体正常生长代谢功能。这一系列生物学反应被称为“氧化应激”[45]。微藻抗氧化防御系统包括一系列酶清除剂,如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX), 以及非酶抗氧化剂, 如色素、多糖、多酚、脯氨酸、类胡萝卜素和类黄酮等[46,47]。本研究发现, 在5℃培养前期, 段殖黄线藻SOD和CAT的酶活性不断增强, 到第5天时, 18 mmol/L低温预处理组SOD活性增幅达到52.8%; CAT酶活性增长了近一倍, 以此保护机体免受低温诱导的氧化损伤。并且, 经过低温预处理后的段殖黄线藻SOD和CAT的活性会显著(P＜0.05), 甚至是极显著(P＜0.05)高于常温实验组, 表明前者对低温胁迫的氧化应激反应更加快速和灵敏。

3.5 段殖黄线藻适应低温的生理学机制及展望

对于许多适冷微藻来说, 经过长期的适应和进化已经具备了大量应对低温的抗逆性策略, 例如增加膜的流动性[48]、分泌细胞相容性物质维持渗透压平衡[49]、产生多种冷适应蛋白抑制冰晶的生长[50]及在分子水平[51,52]的调节都得到了大量的研究。就段殖黄线藻而言, 在5℃下培养时, 胞内多不饱和脂肪酸(PUFAs)相对含量达到了最高水平, 通过增加不饱和度改变细胞膜脂质双分子层的脂肪酸组成, 降低凝固温度, 是维持其细胞膜流动性最显著的策略之一。细胞内油脂、蛋白质、色素等生化组分之间代谢通路的调节, 进一步对段殖黄线藻的光合效率产生影响, 使其迅速调整至最佳状态、维持自身代谢平衡以适应外部环境的变化。此外, 经过低温预处理后的段殖黄线藻能够迅速增加其抗氧化酶活性, 发生氧化应激反应, 大大提高了其在生物量和脂质等重要代谢产物积累方面的竞争力,对于解决众多嗜冷或适冷型微藻在产业化过程中的生产难题、突破效率难关提供了新的思路和方法。

4 结论

本文探究了温度和氮浓度两种关键因子对低温及常温预处理段殖黄线藻生长和代谢产物积累的影响。研究结果表明: 段殖黄线藻是一典型适冷型微藻, 能够适应低温(5℃)生长, 其最佳生长温度为15—20℃, 低氮胁迫可以促进其大量积累油脂。经低温(5℃)预处理和常温培养的藻种进行对比, 发现低温预处理后的段殖黄线藻对温度的适应性及油脂和不饱和脂肪酸的积累能力均优于常温藻种。在5℃下, 常温处理的段殖黄线藻对光的利用率及最大电子传递速率受到明显抑制, 相反, 低温预处理后的段殖黄线藻光合效率则大幅提升。根据抗氧化酶活性分析, 低温预处理后超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性显著高于常温段殖黄线藻(P＜0.05)。综上表明, 经过低温预处理后的段殖黄线藻通过快速提升光合活性和抗氧化能力, 能够更好地适应低温并促进其生物质和代谢产物的积累。