经电子支气管镜下肺泡灌洗液行宏基因组测序在呼吸机相关性肺炎的应用价值

陈伟光 张晶晶 江春虾 郑耿正 胡欣欣 罗时俊

呼吸机相关性肺炎(ventilator-associated pneumonia,VAP)是患者于机械通气48 h 至拔管48 h 期间出现的肺部感染, 属于具有医院获得性、感染性的常见疾病,治疗难度很高, 可导致延迟拔管、脱机困难等, 进而增加患者治疗时间、治疗费用及死亡率［1］。早期合理恰当的诊断治疗对VAP 患者预后改善、死亡率降低具有重要的意义, 因此, 病原体的精准诊断对感染性疾病的诊断非常重要［2］。电子支气管镜能够于病变区域直接取样本, 防止由于口咽处的微生物污染样本, 使样本内病原菌分离提升, 经电子支气管镜下肺泡灌洗液分析VAP 患者的主要病原体, 明确肺炎为何种病原体感染所致［3］。宏基因组二代测序(metagenomics nextgeneration sequencing, mNGS)具有无偏倚性、广覆盖、快速等优点, 能覆盖更广泛病原体, 可直接从临床样品内将DNA/RNA 提取出来, 选择mNGS, 经数据库对比及生物信息学分析, 且不需要特异性扩增, 在诊断疑难感染及急危重症中尤为适用［4,5］。本次研究通过探讨经电子支气管镜下肺泡灌洗液行mNGS 在VAP 患者中的应用价值, 希望能够为患者提供准确的临床诊断及精准治疗依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2022 年1～12 月于深圳市坪山区人民医院重症医学科及呼吸内科住院的40 例VAP 患者作为研究对象。纳入标准：①VAP 患者为在机械通气48 h 之后出现的肺炎, 同机械通气之前的相关检查(胸部CT、胸片)比较显示肺内出现新炎症病灶或有浸润性阴影, 同时具有湿性啰音或肺实变征, 与相关诊断标准［6］相符；②同检查支气管镜的相关指征相符；③均于知情同意书中签名。排除标准：①妊娠期妇女及其家属拒绝配合的患者；②未使用气管插管而取得的肺泡灌洗液的患者；③肺部感染与呼吸机无关的感染；④样本中微生物核酸＜100 copies/ml；⑤有活动性肺结核及新近大咯血者；⑥新型冠状病毒肺炎感染的患者。根据随机数字表法分为对照组与mNGS 组, 各20 例。两组的一般资料比较无意义(P＞0.05), 具有可比性。见表1。

表1 两组一般资料比较［n(%), ±s］

表1 两组一般资料比较［n(%), ±s］

注：两组比较, P＞0.05

组别例数性别平均年龄(岁) C 反应蛋白(mg/L) 降钙素原(ng/ml)白细胞计数(×109/L )男女对照组2015(75.00)5(25.00)57.47±5.5840.25±3.530.17±0.048.35±1.48 mNGS 组2012(60.00)8(40.00)60.82±6.0340.33±3.460.19±0.038.38±1.59 χ2/t1.0261.8240.0721.7890.062 P 0.3110.0760.9430.0820.951

1.2 方法 两组患者均进行综合干预, 主要包括呼吸机辅助通气、肠内营养支持、抗感染、脏器功能支持等。对照组应用传统病原微生物检测, mNGS 组应用mNGS, 具体方式如下：①肺泡灌洗液收集及送检：灌洗肺泡时, 于灌洗肺段的活检孔内注射1～2 ml 的2%利多卡因, 之后把支气管镜顶端的楔入段(或亚段)置于支气管开口部分, 把灭菌生理盐水(37℃)注射于活检孔, 并负压使液体被吸引、回收, 30～50 ml/次, 总量100～250 ml, 经电子支气管镜下取得肺泡灌洗液样本2 份, 送医院传统微生物培养以及广州华银健康检验中心进行mNGS。②样本量：对照组患者需要肺泡灌洗液样本≥10 ml, 并需及时送检；mNGS 组采集的肺泡灌洗液要＞5 ml, 存于4～20℃的环境中, 在2 h 之内送检,若送检不及时, 肺泡灌洗液需存于-20℃的环境中, 并于24 h 内送检。③mNGS 判定方法［7］：mNGS 技术通过高通量测序及智能算法进行分析, 得到疑似病原微生物的种类信息, 特异性序列数, 无偏向性鉴定微生物。a.阳性：按照名古屋大学(日本)医学院编制的评估手段, Reads 细菌＞200, 同时P1(在全部微生物中的占比)＞0.5；b.致病及定植(微生物)的高通量测定：结合临床, 若合并发热、炎症、痰液性状转变、影像学变化, 就属于致病菌；若未见感染征象, 属于定植菌。④应用抗生素方案：对照组按照临床培养结果决定是否调整抗生素, mNGS 组阳性者按照病原体测定结果调整抗生素(即单一窄谱抗菌药物), 阴性者持续经验性用药。

1.3 观察指标及判定标准 对比两组患者的病原体种类检出率、病原体种类数检出率、抗生素使用强度(包括抗生素使用率及使用时间)、机械通气时间、ICU 住院时间、MODS 发生率及两种检测方式对VAP 的诊断效能。机械通气时间：患者气管插管至能够成功拔管的时间, 患者恢复自主呼吸, 病情稳定, 未出现严重并发症, 血气分析未见代谢性、呼吸性酸碱失衡, 同时使用呼吸机辅助的参数递减后可以满足人体呼吸需要,就可拔管。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t 检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验；诊断效能采用受试者工作特征曲线(ROC 曲线)分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组病原体种类检出率比较 mNGS 组患者的细菌检出率为80.00%, 明显高于对照组的20.00%(P＜0.05)；两组真菌、病毒检出率比较, 差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 两组患者病原体种类检出率比较［n(%)］

2.2 两组患者病原体种类数检出率比较 mNGS 组患者病原体种类数＞2 种检出率为30.00%, 明显高于对照组的0(P＜0.05)。见表3。

表3 两组病原体种类数检出比较［n(%)］

2.3 两种检测方式对VAP 的诊断效能比较 mNGS诊断VAP 的AUC 为0.941, 明显大于传统病原微生物检测的0.714(P＜0.05)。见表4, 图1, 图2。

图1 mNGS 检测诊断VAP 的ROC 曲线

图2 传统病原微生物检测诊断VAP 的ROC 曲线

表4 两种检测方式诊断VAP 的ROC 曲线结果

2.4 两组患者抗生素使用强度、机械通气时间、ICU住院时间、MODS 发生率比较 mNGS 组患者的抗生素使用率55.00%明显低于对照组的90.00%, 抗生素使用时间、机械通气时间、ICU 住院时间明显短于对照组, MODS 发生率5.00%明显低于对照组的30.00%(P＜0.05)。见表5。

3 讨论

目前, 对于VAP 的治疗, 临床上常采用抗生素抗感染、吸痰等对症治疗, 但抗感染治疗需要依据呼吸道标本的病原学结果针对性的选择抗菌药物。通常,临床治疗中会依据经验应用抗生素, 然后送痰液(或肺泡灌洗液)标本进行微生物涂片、培养, 依据结果判断抗生素是否需要调整［8］。因为微生物常规培养阳性率较低, 同时极易受诸多不确定因素干扰, 进而造成抗生素滥用、多用。肺泡灌洗液是最为合理的标本, 留取标本离不开支气管镜, 目前, 支气管镜广泛应用于肺部、气管支气管等呼吸系统疾病的诊疗中, 这一方式能够从病变位置直接将样本提取出来, 防止样本被口咽处存在的微生物污染, 进而使样本内病原菌的分离提高［9］。通过支气管肺泡灌洗液分析VAP 患者的主要病原体, 明确肺炎为何种病原体感染所致。

mNGS 技术于辨别病菌(厌氧菌、真菌及部分潜在病原体)、混合性肺部感染诊断以及探索经验性抗菌干预欠敏感患者的致病病原体领域都可发挥较高的作用［10］。mNGS 不需要培养且没有偏好性, 能够从临床样本内直接获得DNA/RNA, 通过高通量测序及智能算法进行分析, 得到疑似病原微生物的种类信息, 同时不需要特异性扩增, 在诊断疑难感染及急危重症中尤为适用［11］。伴随宏基因组检测技术的不断发展, VAP 患者于常规病原学的基础上需及时开展宏基因组检测,通过这一方法的阳性判定, 同时联合患者实际状况开展全面分析, 进而明确是否为背景菌、定植菌或致病菌［12-15］。相对传统病原微生物检测方法, mNGS 检测方法相对于常规细菌培养具有快速、敏感性高的优势,具备重要的诊断价值, 可提高患者病原体的检出率, 特别是对病毒、真菌及特殊病原体, 于传统培养中不能检测出病原体的患者中, mNGS 能够有效的检出, 从而指导抗病原微生物药物的应用, 提升治疗效果, 节约医疗资源及患者总费用［16-19］。且有研究显示mNGS 在鉴定病原体方面灵敏度较高, 同时抗生素对其的干扰较小［20-23］。

本研究显示, 经电子支气管镜下肺泡灌洗液行mNGS 患者的细菌检出率、病原体种类数＞2 种检出率明显高于行传统病原微生物检测的患者。ROC 结果中,mNGS 诊断VAP 患者的AUC 为0.941, 明显高于传统病原微生物检测的0.714。行mNGS 患者的抗生素使用率、抗生素使用时间、机械通气时间、ICU 住院时间、MODS 发生率明显低(短)于行传统病原微生物检测的患者, 这提示VAP 患者经电子支气管镜下肺泡灌洗液行mNGS 能够提升病原体检出率, 进而及时得到治疗,提升疗效, 进而降低抗生素使用强度、缩短机械通气时间、住院时间与MODS 发生率, 使患者的预后得到极大的改善。

综上所述, 经电子支气管镜下肺泡灌洗液行mNGS在VAP 患者中的应用价值较高, 能使检出感染病原体的几率提高, 进而降低抗生素使用强度、缩短机械通气时间, 尽可能使患者早脱机早拔管, 对患者病情快速准确诊断、及时采取针对性治疗措施意义重大, 值得大力推广。