真武汤对糖尿病肾病大鼠肾功能、蛋白尿和血液流变学的影响

戴临风 张焕 陈旭 冯月男 张瑶

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的主要微血管并发症,也是许多终末期肾病(ESRD)的主要原因。糖尿病肾病的特征是肾小球滤过率增加, 伴有肾小球内高血压和临床进行性蛋白尿, 随后最终丧失肾功能。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分［1］, 在糖尿病肾病的肾功能损伤中起着关键作用。足细胞损伤主要表现为足突回缩、脱落以及足细胞相关蛋白nephrin 的异常表达, 导致肾小球基底层增厚、系膜扩张和肾小球硬化等一系列肾脏结构异常［2］, 高血糖和高血压的多种干预措施并不能有效降低或逆转肾病的进展, 相当一部分糖尿病患者仍患有进行性和严重的肾损伤。因此,迫切需要开发新的、有效的肾脏保护方法来治疗糖尿病肾病。真武汤出自东汉张仲景的《伤寒论》, 是温阳利水的经典组方, 由附子、白术、茯苓、白芍和生姜组成, 目前, 已有研究表明真武汤能有效治疗糖尿病肾病［3］, 但是其治疗机制尚不清楚, 本研究使用诱导的糖尿病肾病大鼠模型来评估真武汤对肾功能和血液流变学的影响及其潜在的因果机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物 24 只6 周雄性的健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(240～280 g), 购自中国科学院上海实验动物中心。所有动物被饲养在温度23～25℃下, 明暗周期12 h,自由饮食、饮水。本研究根据中国科学技术部《实验动物护理和使用指南》的建议进行。

1.2 试剂 真武汤(附子9 g、生姜9 g、茯苓9 g、白术6 g、白芍9 g)原料由本院中药房提供, 每种药品的凭证标本存放在黑龙江省医院。将生药用蒸馏水浸泡30 min 后再煎附子30 min, 加入其他药物煮1 h 并过滤。将过滤后的液体浓缩液储存于4 ℃下, 使用前用蒸馏水稀释。柠檬酸三钠购自国药集团, STZ 购自Sigma。

1.3 研究方法 24 只大鼠被分为正常组(8 只)和模型组(16 只), 正常喂养1 周后, 模型组大鼠高脂高糖喂养8 周, 禁食8～12 h 后腹膜内注射给予溶于柠檬酸盐缓冲液(0.1 mol/L, pH=4.5)的STZ 65 mg/kg, 2 周后测定血糖和尿蛋白, 以血糖＞16.7 mmol/L、24 h 尿蛋白定量＞50 mg 判定为糖尿病肾脏疾病建模成功, 正常组大鼠腹膜内注射等体积的柠檬酸盐缓冲液, 建模成功后将模型组动物分为模型对照组(8 只)和真武汤组(8 只),真武汤组同时给予5.0 g/(kg·d)、10 ml/kg 的真武汤灌胃给药, 模型对照组和正常组给予等体积去离子水灌胃, 连续喂养16 周。在实验结束时, 通过颈椎脱位处死大鼠, 切除肾脏并在测试前保持在液氮中。

1.4 观察指标

1.4.1 生化指标 实验第27 周, 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉, 从股动脉抽取血样, 采用酶联免疫法测量FBG、BUN、Cr, 通过代谢笼单独收集大鼠24 h 尿液。采用BCA 蛋白法测定24 h 尿蛋白定量。

1.4.2 血液流变学检测 实验第27 周, 使用全自动血液流变学检测仪(Suceder, SA-5600)对采集的大鼠血液进行血液流变检测, 包括红细胞压积、红细胞计数、红细胞聚集指数、红细胞变形指数。

1.4.3 nephrin、podocin 表达水平 实验第27 周,用Trizol 试剂(Invitrogen) 从SD 大鼠的肾组织中提取总RNA, 定量后, 使用反转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA, 使用荧光定量PCR 试剂盒说明书扩增大鼠nephrin、podocin 和组成型表达的管家基因β-肌动蛋白的cDNA, 引物设计如下：nephrin：上游AACGGGCATTACTGGTCTG, 下游TTCAGGCCTGGC CAATCAAT；podocin：上游TGACCTGTGTTTGGGGC ATC, 下游CAGCAATCACCCGCACTTTG。

1.5 统计学方法 所有数据使用SPSS26.0 进行分析。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 多组比较采用方差分析, 两组比较采用独立样本t 检验。P＜ 0.05 被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠的生化指标比较 实验第27 周, 三组大鼠的FBG、24 h 尿蛋白定量、BUN、Cr 比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；与正常组比较, 模型对照组及真武汤组的FBG、24 h 尿蛋白定量、BUN、Cr 均明显升高(P＜0.05)；与模型对照组比较, 真武汤组的24 h尿蛋白定量、BUN、Cr 均明显降低(P＜0.05)。见表1。

表1 三组大鼠的生化指标比较( ±s)

表1 三组大鼠的生化指标比较( ±s)

注：与正常组比较, aP＜0.05；与模型对照组比较, bP＜0.05

组别只数FBG(mmol/L)24 h 尿蛋白定量(mg/24 h)BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)正常组8 6.42±0.83 5.12±0.76 8.41±0.42104.48±18.72模型对照组821.24±2.22a27.23±4.10a26.27±1.74a 311.91±19.94a真武汤组820.22±2.19a 10.12±1.87ab 12.94±2.02ab 194.95±17.42ab F 157.917176.558324.570282.119 P 0.0000.0000.0000.000

2.2 三组大鼠的血液流变学指标比较 实验第27 周,三组大鼠的红细胞压积、红细胞计数、红细胞聚集指数、红细胞变形指数比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；与正常组比较, 模型对照组及真武汤组的红细胞压积、红细胞计数、红细胞聚集指数均明显升高, 模型对照组的红细胞变形指数明显降低(P＜0.05)；与模型对照组比较, 真武汤组的红细胞压积、红细胞计数、红细胞聚集指数均明显降低, 红细胞变形指数明显升高(P＜0.05)。见表2。

表2 三组大鼠的血液流变学指标比较( x-±s)

2.3 三组大鼠的nephrin、podocin 表达水平比较 实验第27 周, 三组大鼠的nephrin、podocin 表达水平比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；与正常组比较, 模型对照组及真武汤组的nephrin、podocin 均明显降低(P＜0.05)；与模型对照组比较, 真武汤组的nephrin、podocin 均明显升高(P＜0.05)。见表3。

表3 三组大鼠的nephrin、podocin 表达水平比较( ±s)

表3 三组大鼠的nephrin、podocin 表达水平比较( ±s)

注：与正常组比较, aP＜0.05；与模型对照组比较, bP＜0.05

组别只数nephrinpodocin正常组81.80±0.091.94±0.08模型对照组8 1.00±0.07a 0.99±0.05a真武汤组8 1.54±0.06ab 1.61±0.07ab F 275.167462.377 P 0.0000.000

3 讨论

糖尿病肾病是一种慢性肾疾病, 主要表现为肾毛细血管破裂、肾小球毛细血管和肾小管间质损伤［4,5］。高糖高脂饮食与STZ 注射液相结合, 可引起胰岛素抵抗, 并显著增加血糖水平, 进而引发糖尿病, 进而建立成功的糖尿病大鼠模型, 与先前的研究报告相似［6-8］。糖尿病会导致大量的高血糖从肾脏排出, 导致肾小球的滤过率增加, 最终导致肾脏功能丧失, 目前, 糖尿病肾病的治疗通常集中在胰岛素、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂上, 但这些方法仍不能有效的降低或逆转糖尿病肾病患者进展为ESRD, 传统草药化合物通过多种方式为糖尿病肾病的管理提供了显著的优势和实用性, 并被公认为传统药物的有效替代品。本研究旨在观察真武汤对糖尿病肾病大鼠肾脏功能的影响。

糖尿病肾病属于“消渴”、“尿浊”、“水肿”、“肾消”等范畴, 其发病机制主要是会增加尿蛋白的排除,从而损害肾脏功能。本研究结果显示, 与模型对照组比较, 真武汤组24 h 尿蛋白定量、BUN、Cr 均明显下降(P＜0.05), 这说明真武汤可能有效改善糖尿病肾病大鼠肾功能, 改善蛋白代谢紊乱, 分析原因真武汤方剂中附子温肾阳, 可用于肾阳不振, 无力化气行水, 以至尿少之水肿；茯苓、白术为臣药, 淡渗利水, 健脾燥湿,使水有所制；白芍以养血柔肝为主, 具有通脉、利小便的功能。另外, 现代药理研究表明［9］, 真武汤能增加尿量, 促钠、钾离子的排出, 改善肾小球滤过膜的通透性的同时, 也促进Cr、BUN 等代谢产物的排出, 减少蛋白的过量损失。

血液流变学变化与肾病的进展密切相关［10］。血液流变学变化, 如高凝状态、高粘度和血流缓慢, 可能加速肾损伤。本研究显示糖尿病肾病大鼠红细胞压积、红细胞聚集指数和红细胞计数均显著升高。红细胞压积与全血粘度密切相关。红细胞聚集水平升高会使红细胞容易聚集成一串, 并导致血液粘度升高真武汤治疗可显著降低红细胞聚集指数, 其药理作用可能与降低血液粘度有关。本研究结果没有观察到真武汤对高血糖的显著影响(P＞0.05), 一项研究表明［11］, 通过足细胞特异性缺失葡萄糖转运蛋白成员4 来保护足细胞免受高血糖的影响, 可不通过降低血糖水平预防肾小球疾病和糖尿病相关蛋白尿的进展, 故本研究推测真武汤在预防蛋白尿和改善肾功能方面具有潜在的应用潜力, 不依赖于血糖降低途径。nephrin 和podocin 是足细胞相关蛋白, podocin 是足细胞中唯一整合膜蛋白,能够与nephrin 相互作用形成足细胞裂孔膜支架, 控制肾小球滤过膜通透性, nephrin 表达缺失或细胞内信号传导异常将导致足细胞形态改变和蛋白尿产生, 本研究结果与模型对照组比较, 真武汤组nephrin、podocin均明显提高(P＜0.05), 这提示真武汤可减轻肾小球肥大,改善高血糖症, 对足胶质细胞损伤具有多重保护作用。

综上所述, 真武汤可通过改善代谢紊乱、增加nephrin 和podocin 基因表达, 有效减轻糖尿病肾病大鼠的肾损伤, 改善肾功能, 真武汤可能是治疗糖尿病肾病的有效途径。