前列腺癌组织中Wnt5a的表达与血管生成拟态的相关性

刘彼得，李循，王书恒，贾宏亮，张小安，李九智

0 引言

前列腺癌（prostate cancer, PCa）为男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，随着人口老龄化的加重，我国PCa发病率及死亡率呈上升态势[1]。血管生成拟态（vasculogenic mimicry, VM）是由肿瘤细胞围成的具有内皮性血管功能的管状结构，已在包括PCa在内的多种实体恶性肿瘤组织中被证实存在，并与肿瘤的恶性程度及不良预后相关[2]。VM的形成涉及肿瘤细胞可塑性及模拟内皮细胞的过程，这与肿瘤干细胞（cancer stem cells, CSCs）及上皮向间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）密切相关[2-3]。Wnt5a是Wnt非经典信号通路配体，Wnt5a不仅参与调控CSCs特性和EMT进程，且有研究报道其能够促进卵巢癌、非小细胞肺癌及脉络膜黑色素瘤VM的形成，但Wnt5a对PCa的VM调控作用尚未被探究[4-7]。故本研究通过免疫组织化学法检测PCa组织中Wnt5a的表达及VM的形成情况，并收集PCa患者的临床病理资料，从人体组织水平初步探究Wnt5a与VM形成的相关性及临床意义。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 组织标本 收集新疆维吾尔自治区人民医院2019—2020年间行PCa根治术的患者组织标本50例，所有患者术前均未接受内分泌治疗、放疗、化疗及免疫治疗等，并以年龄及体重指数1:1匹配收集良性前列腺增生患者组织标本50例。标本经福尔马林固定、常规石蜡包埋，并经病理医师明确诊断。收集患者一般资料及临床病理资料。

1.1.2 主要试剂 Wnt5a抗体（1:200）和Vimentin抗体（1:500）购自英国Abcam公司，E-cadherin抗体（1:1 000）和CD133抗体（1:1 000）购自美国Proteintech公司，CD34抗体（1:200）、HRP-山羊抗兔二抗（1:5 000）和HRP-山羊抗小鼠二抗（1:5 000）购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 组织切片脱蜡、水化，采用高压修复法进行抗原修复，5%BSA封闭20 min后滴加一抗，室温孵育1 h后转入4℃恒温箱过夜，滴加二抗室温孵育1 h，DAB和苏木精显色后，梯度脱水封片，由两名医师在显微镜下共同评估蛋白表达情况。

1.2.2 CD34/PAS双染 按照上述步骤进行CD34染色后，0.5%PAS溶液37℃孵育10 min，苏木精对比染色后，梯度脱水封片。

1.2.3 免疫组织化学染色判读标准 每例标本取10个含有阳性细胞的高倍视野（×200）分别计数100个肿瘤细胞或增生腺体细胞，取其平均值计算阳性细胞百分率，0分：阳性细胞占0～5%；1分：阳性细胞占5%～25%；2分：阳性细胞占25%～50%；3分：阳性细胞＞50%。染色强度：0分：无明显染色；1分：与基质相比有轻微染色；2分：易见的深黄色；3分：棕黄色。染色指数为阳性细胞百分率和染色强度之和，最终将染色结果分为两组：阴性和弱阳性为一组（0～2分），以低表达表示；中等阳性和强阳性为一组（3～6分），以高表达表示。

1.2.4 CD34/PAS双染判读标准 CD34染色位置为血管内皮细胞，定位在细胞膜，颜色呈棕黄色，PAS着色于基底膜，呈樱桃红色。内皮细胞性血管CD34和PAS均染色阳性；VM的CD34染色阴性，PAS染色阳性，且管道内可见红细胞。观察并计数整张切片上VM的数量，有则为阳性，无则为阴性。

1.3 统计学方法

用SPSS21.0软件进行统计学分析，采用χ2检验分析Wnt5a在两组间的表达差异，以及Wnt5a和VM的临床意义，Spearman相关性分析Wnt5a和VM的相关性及与CD133、Vimentin、E-cadherin表达的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Wnt5a在PCa组织及良性前列腺增生组织中的表达情况

前列腺上皮细胞及间质细胞均表达Wnt5a，以上皮细胞表达为著。在PCa组织中Wnt5a的高表达率为72.0%，良性前列腺增生组织中高表达率为50.0%，两组比较差异有统计学意义（P=0.024），见图1、表1。

表1 Wnt5a蛋白在PCa组织及良性前列腺增生组织中的表达Table 1 Expression of Wnt5a protein in prostate cancer tissues and benign prostatic hyperplasia tissues

图1 Wnt5a在PCa组织及良性前列腺增生组织中的IHC染色结果 (×200)Figure 1 IHC staining results of Wnt5a in PCa and benign prostatic hyperplasia tissues (×200)

2.2 PCa组织中VM的形成情况及与Wnt5a表达的关系

CD34可将内皮细胞染色，PAS着色于血管样结构的基底膜，经CD34/PAS双染可见，在PCa组织中CD34染色阴性而PAS染色阳性的肿瘤细胞围成的管腔样结构为VM（图2A）；而CD34和PAS均染色的管腔样结构为内皮细胞血管（图2B），前列腺癌组织中VM阳性率为38.0%（19/50）。前列腺癌组织中VM的形成与Wnt5a的表达具有正相关性（r=0.396,P=0.004），见表2。

表2 PCa组织中Wnt5a、VM及CSCs/EMT标志蛋白表达的相关性Table 2 Correlation among Wnt5a expression, VM, and CSCs/EMT-related protein expression in prostate cancer tissues

图2 VM在前列腺癌组织中的染色情况 (×200)Figure 2 Morphology of VM in prostate cancer tissues by CD34/PAS double staining (×200)

2.3 PCa组织中Wnt5a的表达及VM与CSCs/EMT标志蛋白表达的关系

E-cadherin为上皮特异性标志蛋白，Vimentin为间皮特异性标志蛋白，由图3及表2可见，PCa组织中Wnt5a的表达与Vimentin的表达呈显著正相关（r=0.673,P＜0.001），而与E-cadherin的表达无显著相关性；且VM的存在同样与Vimentin的表达呈显著正相关（r=0.303,P=0.033），而与E-cadherin的表达无显著相关性。CD133为CSCs标志蛋白，其在前列腺癌组织中的表达与Wnt5a的表达（r=0.603,P＜0.001）及VM（r=0.396,P=0.004）均呈显著正相关。

图3 免疫组织化学染色检测PCa组织中CSCs及EMT标志蛋白的表达情况 (×200)Figure 3 IHC staining results of CSCs/EMT-related proteins in prostate cancer tissues (×200)

2.4 PCa组织中Wnt5a的表达及VM与临床病理特征的关系

W n t 5a 蛋 白 的 表 达 与PCa的G lea so n 评 分（χ2=15.675,P＜0.001）、输精管侵犯（χ2=4.049,P=0.044）及淋巴转移（χ2=1.049,P=0.044）均呈正相关。PCa组织中VM的形成同样与Gleason评分（χ2=12.738,P＜0.001）、输精管侵犯（χ2=5.995,P=0.014）及淋巴转移（χ2=5.995,P=0.014）呈正相关，此外还与肿瘤T分期正相关（χ2=4.529,P=0.033），见表3。

表3 PCa组织中Wnt5a的表达及VM与临床病理特征的关系Table 3 Relationship between Wnt5a expression, VM and clinicopathological factors of prostate cancer patients

3 讨论

血管作为维持肿瘤生长必需的营养通道，是肿瘤微环境的重要调节因素，靶向于肿瘤血管的治疗应为理想的抗癌方式，抗血管靶向药物已被证实对多种肿瘤显著有效。然而临床试验却发现，现有的抗血管靶向药物对PCa疗效甚微，尤其是对去势抵抗性PCa，其机制可能涉及肿瘤微环境缺氧及VM的激活[8]。既往研究表明肿瘤微环境与PCa的治疗耐受及进展密切相关，因此针对肿瘤微环境的研究可能是改善进展性PCa治疗现状的关键[9-10]。故本研究从VM的角度，在PCa组织水平初步探究Wnt5a与VM的相关性，同时分析其与CSCs和EMT的关系，为发掘新的PCa治疗靶点提供基础性依据。

本研究通过CD34/PAS双染对PCa组织进行VM检测，结果表明其与PCa的恶性程度、侵犯及转移呈正相关，提示VM可能为进展性PCa的潜在治疗靶点。靶向于VM的研究也证明，抑制VM的形成并与血管内皮细胞靶向药物或其他疗法进行组合，可能是治疗PCa（尤其是预后不良的PCa）的重要方向[2]。目前虽有研究表明一些有机化合物（如表没食子儿茶素没食子酸酯及山奈酚）能够抑制PCa的VM形成，但形成VM的机制尚未完全阐明，目前亦缺乏对PCa的VM形成机制的研究，这促使学者们对其展开探索[11-12]。

CSCs和EMT在VM的形成中起到重要作用[2-3,13]。已有研究证实，源自三阴性乳腺癌细胞的干细胞样细胞能够直接构成VM结构，然而目前尚无研究证实PCa的VM形成与CSCs及EMT的确切关系[14]。本研究从前列腺癌组织水平初步证明，CSCs标志因子CD133及间皮细胞特性标志因子Vimentin的表达与VM的形成具有明显正相关性，提示CSCs及EMT可能为促进PCa形成VM的因素。

CSCs、EMT 及VM受多种信号通路的调控，并存在交互、重叠，其中就包括Wnt信号通路[2,15-16]。研究表明Wnt信号通路与雄激素受体的交互作用在PCa的进展中起到重要作用，其中Wnt5a（Wnt非经典信号通路配体）对雄激素受体的抑制作用以及对PCa进展的促进作用较为显著[17-19]。进一步查阅文献发现Wnt5a能够促进卵巢癌、非小细胞肺癌及脉络膜黑色素瘤VM的形成，但Wnt5a对PCa的VM的调控作用及其机制尚未被探究[5-7]。本研究在PCa组织水平初步证实Wnt5a的表达不仅与VM的形成正相关，还与CD133及Vimentin的表达正相关。此外，通过对临床病理参数的分析发现，Wnt5a可能对PCa的进展起促进作用。由此可见，Wnt5a可能在PCa的发生和进展过程中扮演重要角色，并可能通过促进VM的形成参与PCa的进展，且其对PCa的CSCs及EMT可能存在调控作用。

综上所述，Wnt5a在PCa组织中的表达明显高于良性前列腺增生组织，且在PCa组织中Wnt5a的表达与VM的形成正相关；此外，二者的表达不仅与CSCs及EMT标志蛋白的表达具有正相关性，还与PCa的恶性程度、侵犯及转移正相关。以上结果提示Wnt5a具有作为评估PCa恶性程度及预后新指标的潜力，并有助于开拓PCa靶向治疗的新思路。

利益冲突声明：

所有作者均声明不存在利益冲突。