温度和盐度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体幼虫生长与存活的影响*

张海宁, 徐成勋, 李 琪,2**

(1. 海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学), 山东 青岛 266003;2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266237)

长牡蛎(Crassostreagigas)作为全球性重要的经济贝类,具有生长速度快、抗逆性强、肉质鲜美、营养丰富等特点。长牡蛎“海大1号”是以生长速度和壳型为选育目标,通过群体选育培育出的新品种[1]。然而,长牡蛎“海大1号”与其他传统养殖的二倍体牡蛎一样,由于夏季繁殖期配子排放导致软体部消瘦,无法供应市场。与二倍体牡蛎相比,三倍体牡蛎育性相对较差,在繁殖季节也能保持良好的肉质,弥补夏季二倍体牡蛎市场短缺,可以保障全年供应[2]。因此,开展长牡蛎“海大1号”三倍体苗种的规模化繁育与产业化应用对推动牡蛎养殖产业的发展具有重要意义。

幼虫培育是牡蛎苗种生产的重要环节,了解幼虫对养殖环境的偏好对于最大限度地提高育苗场的产量至关重要,而环境条件在无脊椎动物幼虫发育中起着至关重要的作用。通常情况下,在探究培育幼虫适宜条件时,除食物的质量和数量,需要考虑温度和盐度的适应性[3-4]。温度是影响贝类幼虫生长和存活的重要环境因素,高温会导致海洋贝类幼虫大量死亡,而低温则会导致大部分海洋贝类幼虫生长缓慢[5-7]。盐度影响幼虫的生理反应,双壳贝类的渗透压调节功能受海水盐度的影响,盐度变化超过其自身调节能力是导致双壳贝类死亡的重要原因之一[8-9]。有关温度、盐度对贝类生长发育的影响已有大量报道,阐明温度和盐度对长牡蛎(C.gigas)[6]、岩牡蛎(Crassostreanippona)[10]、栉孔扇贝(Chlamysfarreri)[9]、菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[11]、钝缀锦蛤(Tapesdorsatus)[12]幼虫及稚贝生长发育的影响,可为优化贝类幼虫培育条件提供基础数据。研究幼虫培育的最佳环境条件有助于提高幼虫的生长和存活,缩短幼虫培育周期的同时降低生产成本。本文研究了温度与盐度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体幼虫生长和存活的影响,旨在为长牡蛎“海大1号”三倍体苗种规模化扩繁提供理论基础和实践经验。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验在烟台莱州利滔育苗场进行,所用亲贝为1龄长牡蛎“海大1号”二倍体和四倍体,均取自山东荣成桑沟湾海区。挑选壳色性状优良、壳型规则、外表无损伤的个体作为亲贝,利用流式细胞仪(Beckman CytoFLEX)检测亲贝倍性。

1.2 实验设计

实验设计4个温度梯度:20、25、30和35 ℃,海水盐度设置为30;设置5个盐度梯度:20、25、30、35和40,水温设置为25 ℃。水温通过冷水机或加热器控制,使用水温计测定水温。低盐海水通过向过滤海水中加入曝气24 h的自来水配制,高盐海水通过向过滤海水中加入海水晶配制,使用盐度计(ATAGO)测量盐度。采用解剖法获得长牡蛎“海大1号”二倍体精卵和四倍体的精子。取长牡蛎“海大1号”二倍体卵子,260目筛绢过滤后,在砂滤海水中熟化1 h。二倍体和四倍体牡蛎的精子于授精前10 min挤出备用,授精时将卵液平均分为9份,并分别加入长牡蛎“海大1号”二倍体和四倍体的精子。每个实验组设置3个重复。

1.3 日常管理

授精后放置于60 L聚乙烯桶中孵化。实验过程中每天换水1次,换水量为总体积的1/3,随着幼虫的生长,逐渐增加换水量至1/2。饵料以等鞭金藻(Isochrysisgalban)为主,后期辅助投喂亚心形扁藻(Marinemicroalga)和小球藻(Chlorellavulgaris),每天投喂3次,投饵量根据幼虫的摄食和水中残饵情况确定。各实验组投饵、换水、充气等操作一致。

1.4 指标测定

幼虫孵化后每4天取样一次,每组随机取30个幼虫测量。采用五点取样法取样,即从每组内的5个不同位置取样,每个位置取样20 mL,共取样100 mL幼虫,用卢戈氏液固定,在显微镜下测量其壳高。同时测定幼虫密度,每次测定后及时对密度进行均等校正,使各组保持一致,以消减密度效应的影响。根据初始密度、每次调整密度和测定的密度推算幼虫存活率。受精率为受精后4 h卵裂数占总卵数的百分比,孵化率为受精24 h D形幼虫占总受精卵数量的百分比,存活率为存活的幼虫数占初始实验幼虫总数的百分比,变态率为变态的幼虫数占附着基投放时实验幼虫总数的百分比。

1.5 数据分析

数据统计分析采用SPSS 24.0软件处理,显著性水平设为P<0.05。

2 结果

2.1 受精与孵化

2.1.1 不同温度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体受精率与孵化率的影响 25 ℃实验组和30 ℃实验组的长牡蛎“海大1号”二倍体与三倍体的受精率与孵化率均显著高于20 ℃实验组和35 ℃实验组(P<0.05),且温度为25和30 ℃时二倍体组受精率显著高于三倍体组(P<0.05)(见图1)。温度为25 ℃时,长牡蛎“海大1号”二倍体组与三倍体组的受精率最高,分别为92.67%±2.52%和85.33%±2.52%;温度为35 ℃时受精率最低,分别为51.67%±2.52%和48.33%±4.16%,且显著低于其他温度组(P<0.05)。在相同温度条件下,二倍体组孵化率高于三倍体组但差异不显著(P>0.05),温度为25 ℃时,长牡蛎“海大1号”二倍体组与三倍体组的孵化率最高,分别为81.67%±4.55%和76.41%±5.78%;温度为35 ℃时孵化率最低,分别为28.80%±4.10%和25.27%±3.91%,且显著低于其他温度组(P<0.05)。

(同一指标具有相同字母表示组间差异不显著(P>0.05),具有不同字母表示组间存在显著差异(P<0.05)。 Same indicator with the same letter means that the difference between groups is not significant(P>0.05), and with different letters means that there is a significant difference between groups(P<0.05).)

2.1.2 不同盐度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体受精率与孵化率的影响 盐度为25、30和35时,长牡蛎“海大1号”二倍体组受精率显著高于盐度为20和40时(P<0.05);盐度为25、30、35和40时,长牡蛎“海大1号”三倍体组受精率显著高于盐度为20时(P<0.05),盐度为30和35时二倍体组受精率显著高于三倍体组(P<0.05)(见图2)。长牡蛎“海大1号”二倍体组与三倍体组在盐度为30时的受精率最高,分别为92.67%±2.52%和85.33%±2.52%;盐度为20时受精率最低,分别为58.00%±3.00%和59.00%±2.00%,且显著低于其他盐度(P<0.05)。

(同一指标具有相同字母表示组间差异不显著(P>0.05),具有不同字母表示组间存在显著差异(P<0.05)。 Same indicator with the same letter means that the difference between groups is not significant(P>0.05), and with different letters means that there is a significant difference between groups(P<0.05).)

盐度为25、30和35时,长牡蛎“海大1号”二倍体组和三倍体组孵化率显著高于盐度为20和40时(P<0.05)。盐度为20和35时二倍体组孵化率显著高于三倍体组(P<0.05)。盐度为30时“海大1号”二倍体组和三倍体组的孵化率最高,分别为81.67%±4.54%和73.08%±2.07%;盐度为20时“海大1号”二倍体组和三倍体组孵化率最低,分别为55.46%±8.12%和46.27%±3.16%,且显著低于其他盐度组(P<0.05)。

2.2 温度和盐度对幼虫生长的影响

2.2.1 不同温度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体幼虫生长的影响 各温度水平下,长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫始终保持生长优势,其壳高显著高于二倍体幼虫(P<0.05),且三倍体和二倍体幼虫生长最快和最慢的温度分别为30和20 ℃(见图3)。当温度为35 ℃时,第9天二倍体幼虫全部死亡,第13天三倍体幼虫全部死亡。第17天,温度为30 ℃时,二倍体与三倍体幼虫的壳高达到最大值,分别为(302.17±17.01) μm和(319.67±14.26) μm;而温度为20 ℃时,二倍体与三倍体幼虫的壳高最小,分别为(245.51±17.23) μm和(254.05±16.05) μm。

(表示差异显著(P<0.05)。denotes significant difference(P< 0.05).)

2.2.2 不同盐度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体幼虫生长的影响 各盐度水平下,长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫始终保持生长优势,三倍体幼虫的壳高显著高于二倍体幼虫(P<0.05),生长最快和最慢的盐度分别为20和40,而盐度25与30两组之间无明显差异(P>0.05)(见图4)。第17天,二倍体和三倍体幼虫的壳高均在盐度20时达到最大值,分别为(271.66±20.43) μm和(320.49±19.83) μm;在盐度40时出现最小值,分别为(213.46±18.26) μm和(223.51±27.78) μm。

(表示差异显著(P<0.05)。denotes significant difference(P<0.05).)

2.3 温度和盐度对幼虫存活率的影响

2.3.1 不同温度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体幼虫存活率的影响 各温度水平下,长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫始终保持存活优势,三倍体幼虫的存活率显著高于二倍体幼虫(P<0.05)(见图5)。当温度为35 ℃时,第9天二倍体幼虫全部死亡,第13天三倍体幼虫全部死亡。第17天,二倍体在25 ℃时存活率最高为32.67%±4.04%,与在20 ℃时无显著差异(P>0.05);三倍体幼虫在25 ℃时存活率最高为52.00%±6.56%,与在20 ℃时无显著差异(P>0.05)。

(表示差异显著(P<0.05)。 denotes significant difference(P<0.05).)

2.3.2 不同盐度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体幼虫存活率的影响 长牡蛎“海大1号”二倍体幼虫存活率在盐度为25时最高,其次为盐度20,盐度40时存活率最低;三倍体幼虫存活率在盐度为30时最高,其次为盐度25,同样在盐度40时存活率最低;盐度为25时,长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫存活率高于二倍体幼虫,但差异不显著(P>0.05);盐度为30、35和40时长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫存活率显著高于二倍体幼虫(P<0.05)(见图6)。

(表示差异显著(P<0.05)。 denotes significant difference(P<0.05).)

2.4 温度和盐度对幼虫变态率的影响

2.4.1 不同温度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体幼虫变态率的影响 长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体在不同实验温度下的变态率如图7所示。长牡蛎“海大1号”二倍体与三倍体幼虫变态率在25 ℃时最高,在30 ℃时最低,不同温度之间具有显著性差异(P<0.05)。在相同温度下,二倍体幼虫与三倍体幼虫的变态率无显著性差异(P>0.05)。

(同一指标具有相同字母表示组间差异不显著(P>0.05),具有不同字母表示组间存在显著差异(P<0.05)。 Same indicator with the same letter means that the difference between groups is not significant(P>0.05), and with different letters means that there is a significant difference between groups(P<0.05).)

2.4.2 不同盐度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体幼虫变态率的影响 长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体幼虫在不同实验盐度下的变态率如图8所示。长牡蛎“海大1号”二倍体幼虫和三倍体幼虫变态率在盐度为30时最高,在盐度为40时最低。二倍体和三倍体幼虫的变态率在盐度为20、25、30和40时无显著性差异(P>0.05),在盐度为35时,三倍体幼虫的变态率显著高于二倍体幼虫(P<0.05)。

(同一指标具有相同字母表示组间差异不显著(P>0.05),具有不同字母表示组间存在显著差异(P<0.05)。 Same indicator with the same letter means that the difference between groups is not significant(P>0.05), and with different letters means that there is a significant difference between groups(P<0.05).)

3 讨论

3.1 温度和盐度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体受精率与孵化率的影响

在本研究中长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体的受精率与孵化率随着温度和盐度的升高,呈先升高后降低的趋势,这与Han等[13]在长牡蛎二倍体中的研究结果一致。在低温条件下,受精率与孵化率较低可能与温度影响受精卵内酶的活性有关,低温对其正常分裂分化产生了不利影响[14]。水温过高,会导致水中的致病微生物滋生,增加耗氧,这可能是影响受精卵孵化的原因之一[15]。温度为25～30 ℃,盐度为30～35时,“海大1号”二倍体组受精率显著高于三倍体组,表明三倍体组受精卵可能存在一定的“受精卵不育”现象[16],Zhang等[17]研究葡萄牙牡蛎三倍体受精卵与二倍体受精卵的卵裂率时也报道了类似结果。在本研究中,长牡蛎“海大1号”二倍体在受精与孵化方面的表现优于三倍体。在受精和孵化阶段,控制水温在25～30 ℃之间,盐度在25～35之间能减少两者之间的差异,提高三倍体的受精率与孵化率。

3.2 温度和盐度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体幼虫生长与存活的影响

贝类苗种培育成功的关键在很大程度上取决于其生命早期阶段的表现,如胚胎和幼虫阶段。随着温度升高,“海大1号”二倍体与三倍体幼虫的生长加快。这可能由于水温升高使贝类的新陈代谢与摄食消化等能力提高,从而使得幼虫具有更强的运动能力,生长更迅速[18]。值得注意的是,幼虫密度没有作为幼虫生长速率条件实验的一个因素进行检查,幼虫在高温下生长最快可能是由温度和幼虫密度的综合作用导致的。在温度对幼虫存活影响方面,三倍体幼虫的存活率显著高于二倍体幼虫,这表明三倍体幼虫的温度耐受性高于二倍体幼虫。高温条件下幼虫的高死亡率与之前报道的研究一致[13]。温度升高到一定程度,可能会导致水中致病微生物的滋生以及贝类血细胞和酶活性降低,从而对贝类的生长发育以及存活产生不利影响。在本研究中,在幼虫发育的整个阶段相对于长牡蛎二倍体幼虫“海大1号”三倍体幼虫表现出明显的生长优势,这可能与基因杂合度增加使得其生长性能得到改良有关[19];长牡蛎“海大1号”三倍体与二倍体相比,染色体组增加可能带来了剂量效应,即三倍体细胞内可能出现更多与生长相关的基因,使其生长速度加快。这在香港牡蛎(Crassostreahongkongensis)[20]、美洲牡蛎(Crassostreavirginica)[21-22]及扇贝(Argopectenventricosus)[23]等多种双壳贝类中已经证实。在本研究中,三倍体幼虫表现出快速生长特性,其有助于在苗种培育阶段缩短育苗周期从而降低养殖成本。

盐度是影响贝类幼虫环境适应能力的另一个重要的非生物因素,对幼虫的生长和存活具有较大影响。迄今为止,已经进行了许多关于盐度对软体动物生产性能影响的研究[24-25]。在同等环境下,不同物种有不同的适宜盐度范围。在我们的研究中,盐度对生长和存活的影响是显著的,长牡蛎“海大1号”二倍体与三倍体幼虫存活率随着盐度的升高呈先升高再下降的趋势;幼虫的生长速度随着盐度的升高呈下降趋势。在以前对长牡蛎“海大1号”二倍体幼虫的研究中也发现了类似结果[26]。大量研究表明,盐度变化会对海洋贝类渗透压调节产生影响,进而影响个体的生长发育[27-29]。在本研究中高盐条件下生长速度降低,这可能是由于幼虫需要消耗大量的能量来进行渗透压调节,进而导致生长速度减缓。在高盐条件下,长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫相对于二倍体幼虫表现出明显的存活优势,这可能是由于多倍体的染色体增加,从而进化出了新的功能,使潜在的生态位扩张或对环境变化反应的可塑性增强[30-31]。长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫表现出得对温度和盐度的高耐受力,这可能与染色体组增加所引起的环境适应性增强有关。

3.3 温度和盐度对长牡蛎“海大1号”二倍体和三倍体幼虫变态率的影响

在本研究中,长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫相对于二倍体幼虫具有生长快、变态时间短的特点。在温度实验中,长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫与二倍体幼虫的变态率没有表现出明显的差异;而在盐度实验中,在高盐条件下长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫相对于二倍体幼虫表现出显著的变态优势。总体来看,长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫与二倍体幼虫的变态率差异不显著,这说明三倍体幼虫可以正常附着,变态形成稚贝。这与在长牡蛎、美洲牡蛎、香港牡蛎中的研究结果一致[22,32-36]。在本研究中,长牡蛎“海大1号”二倍体与三倍体幼虫的变态率受温度与盐度的影响较大,在生产过程中控制温度在25 ℃左右,盐度在25～35之间能够有效提高幼虫的变态率。

4 结语

为了探究长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫对主要环境因子的适应能力,比较研究了温度和盐度对二倍体和三倍体幼虫生长和存活的影响。研究显示,长牡蛎“海大1号”三倍体幼虫培育的适宜盐度为20～30,适宜温度为20～25 ℃。相对于长牡蛎二倍体 “海大1号”三倍体在幼虫阶段具有生长快、变态时间短的特点,对温度和盐度具有更高的耐受能力。长牡蛎“海大1号”三倍体在幼虫阶段表现出的优势有助于提高在牡蛎苗种生产中的效率。