沙棘中黄酮类化合物提取及抗氧化活性

吴翠芳, 刘雅宣, 李宇辉, 郝奇奇, 何旭豪, 王俊钢*

(1.亳州学院 生物与食品工程系,安徽 亳州 236800;2.亳州市天然产物分离纯化工程技术研究中心,安徽 亳州 236800;3.新疆农垦科学院 农产品加工研究所,新疆 石河子 832000)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.),也称为沙枣、吉汉、酸柳、达普,是胡颓子科沙棘属的一种重要的落叶树种,具有很好的防风固沙作用。目前,沙棘果的营养保健及医疗作用被广泛关注[1]。中国沙棘资源占全世界上95%以上,素有“沙棘王国”之称[2]。沙棘果是一种药食同源食品,具有极高的营养和药用价值,在治疗咳嗽、改善胃肠功能、抗炎、抗病毒、提高免疫力、激发细胞新陈代谢等方面作用显著[3]。沙棘富含黄酮、类胡萝卜素、甾醇激素、生育酚等[4],其中黄酮类化合物是其最重要的活性成分。研究表明,黄酮类化合物可以保护肠道上皮屏障[5-7]、参与免疫调节[8-10]、调节肠道菌群结构[11-12]、维持细胞的健康和保护内皮功能[13]等重要的生理活性。陈薇伊等[14]研究发现,山楂黄酮能显著提升糖尿病小鼠血清和肝脏中SOD、T-AOC、GSH-PX酶活性;李雪涵等[15]研究发现榆荚仁黄酮可显著增强慢性睡眠剥夺小鼠大脑、肝脏、十二指肠中SOD、GPX活性和T-AOC。随着科技的进步和人们对健康的重视程度不断增加,越来越多对人体健康有益的功能性物质被挖掘,并验证其功效[16]。张峰等[17]通过构建氧化应激条件下花青素对小鼠脂代谢及抗氧化性能的模型,发现花青素可以显著提高小鼠肝脏的抗氧化能力和细胞的免疫机能,从而保护肝脏功能。吴冕等[18]将滁菊总黄酮和滁菊多糖进行配伍,发现合理的配比可以显著增强其体内外抗氧化活性。总之,黄酮类化合物的抗氧化活性和增强动物体内抗氧化物质的表达等作用使得其研究被逐渐重视,而沙棘鲜果中含有1 500～3 000 mg/kg总黄酮,其更具研究价值。

植物中黄酮类化合物的提取通常选用乙醇法,借助超声波[19]、表面活性剂[20]等处理手段可增加黄酮得率。为优化沙棘中黄酮的提取方法,提高沙棘黄酮得率,本试验借助超声辅助提取技术,在单因素试验基础上,通过响应面方法确定沙棘中黄酮的最佳提取工艺,并对得到的沙棘黄酮类化合物的体外抗氧化活性进行研究,可为沙棘黄酮的抗氧化性质和抗氧化能力提供基础数据,为下一步开发功能性食品、保健食品等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验原料与试剂

沙棘全果冻干粉(新疆红蚂蚁农业科技有限公司);芦丁(上海源叶生物科技有限公司);无水乙醇(AR,海博生物技术有限公司);亚硝酸钠,硝酸银,氢氧化钠(AR,国药集团化学试剂科技有限公司);亚硫酸铁,水杨酸(AR,天津市兴复精细化工研究院);DPPH(AR,上海源叶生物科技有限公司);抗坏血酸(AR,郑州市化学试剂三厂)。

1.2 仪器与设备

KQ-200VD超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);HH-4B恒温水浴锅(国华(常州)仪器制造有限公司);SY204C电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司);FCD-2000恒温鼓风干燥箱(上海琅轩实验设备有限公司);UV-6000T紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线绘制及回归方程建立 采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法,将20 mg芦丁标准品溶解于少量的60%乙醇中,加60%乙醇定容至100 mL,得到0.2 mg/mL芦丁标准溶液。参照林继辉等[21]方法,分别吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 0.2 mg/mL芦丁标准溶液,分别加入6 mL 30%乙醇溶液、1 mL 5%亚硝酸钠溶液,混匀后放置6 min,加入1 mL 30%硝酸银溶液,混匀静置6 min,加入10 mL 10%氢氧化钠溶液,加入30%乙醇溶液至25 mL,混匀后静置15 min,在510 nm处测定吸光度。得出回归方程y=9.890 6x+0.013 7,R2=0.998 1,表明芦丁标准品的含量与吸光度有良好的线性关系(图1)。

图1 标准曲线与回归方程Fig.1 Standard curve and regression equation

1.3.2 单因素试验 准确称取2.00 g沙棘粉末,固定其他提取因素分别考察提取时间(20、30、40、50、60 min)、提取温度(40、50、60、70、80 ℃)、乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)对黄酮得率的影响。

1.3.3 响应面优化设计试验 利用Design-Expert 8.0.6 设计响应面优化试验方法,提取时间(A)、提取温度(B)、乙醇体积分数(V乙醇/V总)(C)、料液比(D)等4个影响因素为自变量,黄酮得率为因变量,设计四因素三水平的响应面试验(表1)。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Response to flour test factor level table

1.3.4 黄酮得率的测定 通过准确吸取已经处理好的沙棘黄酮溶液,在510 nm处测定吸光度A,获得沙棘黄酮质量浓度,计算沙棘黄酮得率。

1.3.5 DPPH自由基清除率的测定 参考田建华等[22]方法。准确称将沙棘黄酮粗提取物和Vc对照品各0.5 g,用75%乙醇定容至100 mL,配制成5 mg/mL沙棘黄酮粗提取物溶液和Vc对照品溶液。然后分别用75%乙醇溶液将其稀释配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL样品溶液。称取0.79 g DPPH粉末加蒸馏水定容至1 000 mL配制成2 mmol/L的DPPH溶液。分别吸取2.0 mL上述不同质量浓度的沙棘黄酮粗提取物样液,加入2 mL 2 mmol/L DPPH溶液,将溶液在常温下遮光30 min后,于517 nm下测得吸光度A1;分别吸取2.0 mL上述不同浓度的沙棘黄酮粗提取物样液,加入2.0 mL 75%乙醇于相同波长下分别测定其吸光度A2;吸取2.0 mL 2 mmol/L的DPPH溶液加2.0 mL 75%乙醇在517 nm下测定吸光度A0,使用相同的方法测定Vc进行阳性对照试验。DPPH自由基清除率计算公式如式(1)所示:

(1)

其中,A1为2.0 mL样品溶液+2.0 mL 2 mmol/L的DPPH溶液吸光度;A2为2.0 mL样品溶液+2.0 mL 75%乙醇溶液吸光度;A0为2.0 mL 2 mmol/L的DPPH溶液+2.0 mL 75%乙醇溶液吸光度。

1.3.6 羟自由基清除率的测定 参考田建华等[22]方法,略有改进。准确称将沙棘黄酮粗提取物和Vc对照品各0.5 g,用75%乙醇定容至100 mL,配制成5 mg/mL沙棘黄酮粗提取物溶液和Vc对照品溶液。然后分别用75%乙醇将其稀释成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL样品溶液。准确称取1.391 0 g硫酸亚铁加蒸馏水配制成5 mmol/L硫酸亚铁溶液。准确称取0.690 0 g水杨酸加无水乙醇配制成5 mmol/L水杨酸的乙醇溶液、再配制0.1%过氧化氢溶液。分别吸取上述不同质量浓度的沙棘黄酮粗提取物样液2.0 mL,加入5 mmol/L硫酸亚铁溶液、5 mmol/L水杨酸乙醇溶液、0.1%过氧化氢溶液各2 mL,混匀后于530 nm处测定其吸光度A1;分别吸取2.0 mL上述不同浓度的沙棘黄酮粗提取物样液,加入蒸馏水、0.1%过氧化氢溶液、5 mmol/L水杨酸乙醇溶液各2.0 mL,混匀后于530 nm处测定其吸光度A2;吸取蒸馏水、5 mmol/L硫酸亚铁溶液、0.1%过氧化氢溶液、5 mmol/L水杨酸乙醇溶液各2.0 mL,混合均匀后,于530 nm处分别测定其吸光度A0,然后使用相同的方法测定Vc进行阳性对照试验,根据式(2)计算沙棘黄酮粗提取物和Vc的羟自由基清除率:

(2)

其中,A1为2.0 mL样品溶液+2.0 mL硫酸亚铁溶液+2.0 mL过氧化氢溶液+2.0 mL水杨酸乙醇溶液吸光度;A2为2.0 mL样品溶液+2.0 mL蒸馏水+2.0 mL过氧化氢溶液+2.0 mL水杨酸乙醇溶液吸光度;A0为2.0 mL蒸馏水+2.0 mL硫酸亚铁溶液+2.0 mL过氧化氢溶液+2.0 mL水杨酸乙醇溶液吸光度。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析,所有试验均测定3次,结果以“平均值±标准差”表示。P<0.05 表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。采用Origin 8.0软件作图。

2 结果分析

2.1 单因素试验结果

由图2A结果可以看出,提取时间为10～20 min时,沙棘黄酮得率随着提取时间延长呈递增趋势,当提取时间为20 min时沙棘黄酮提取效果最佳,黄酮得率显著高于(P<0.05)其他水平,为1.44 mg/g。然而当提取时间超出20 min后,则黄酮得率逐渐下降(P<0.05),这可能是由于提取时间太久,黄酮类物质受到热量的影响而分解、聚集等一系列化学反应会影响黄酮得率;另一方面,由于乙醇在提取过程容易挥发,导致黄酮得率降低[23]。因此选取20 min为本试验的最佳提取时间。

图2 不同提取条件对沙棘黄酮提取率的影响Fig.2 Effects of different extraction conditions on the extraction rate of sea buckthorn flavonoids注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

从图2B中可以看出,随着提取温度的升高,沙棘黄酮得率整体表现出了先升高后下降的趋势。在提取温度70 ℃时,得率达到了2.09 mg/g,显著高于(P<0.05)其他温度条件。一般来说,温度越高,化学反应越快,提取效果越好,沙棘黄酮得率也就越高,但试验结果却显示在70 ℃后随温度升高黄酮得率反而下降。其原因是提取液在适宜温度条件下,液体分子运动的增加促使了黄酮分子溶出率增高,但是在过高温度条件下,沙棘黄酮的结构也可能会被破坏,也更容易被氧化而生产其他物质[24],从而降低沙棘黄酮得率,故选取70 ℃为后续试验的提取温度。

如图2C所示,沙棘黄酮的得率会因乙醇的比例而发生变化,黄酮得率随乙醇体积分数的增大呈现出先增高后降低的趋势,在乙醇体积分数为50%时,黄酮得率最高,为1.72 mg/g,显著高于其他水平(P<0.05)。Munhoz等[25]研究表明,溶剂的极性对黄酮的提取萃取有一定的影响,黄酮类化合物在乙醇溶液中的溶解度比在水溶液中的溶解度高,就是因为水的极性高,而乙醇的极性低,将乙醇溶液和水溶液混合,降低溶剂极性可以提高黄酮类化合物等酚类化合物的提取率,所以乙醇溶液在溶剂中的浓度越高,极性就越低,提取效果就越好,沙棘黄酮得率越高。当乙醇体积分数大于50%时,黄酮得率显著降低(P<0.05),这可能是沙棘果中其他醇溶性物质的溶出影响了沙棘黄酮类物质的溶出[26],从而导致沙棘黄酮得率降低,故选择乙醇体积分数为50%条件进行后续试验。

由图2D可知,沙棘黄酮得率随料液比比值的增大总体呈现出增加趋势,料液比在1∶15～1∶25 g/mL时,沙棘黄酮得率增长最快,而1∶30～1∶35 g/mL时黄酮得率增长速度减缓。一般来说,溶剂量添加越多,沙棘黄酮得率也越高,但当料液比增加到一定的比值后,溶液中的黄酮类成分已经基本被溶出,故沙棘黄酮得率增加非常缓慢[27]。为了节约成本,减少黄酮类化合物干燥过程中的能耗,因此选择料液比为1∶25 g/mL为最佳料液比。

2.2 沙棘黄酮提取工艺响应面结果

2.2.1 响应面试验设计及结果 采用Design Expert 8.0.6 软件,对沙棘黄酮的提取进行Box-Behnken 设计,响应面试验及结果见表2。

表2 响应面试验及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 响应面结果方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.3 各因素之间交互效用分析 图3为影响沙棘黄酮提取各因素之间的交互效应图,从图中可以直观看出个响应面最大值所对应的因素水平,另外,还可以通过响应面投影的等高线判断这两个因素之间是否存在显著的交互效应[28]。由图3a可知,当乙醇质量分数和料液比一定时,随着提取时间(A)和提取温度(B)的增加,黄酮得率呈现先增加后减小的趋势,从图形中各因素边缘曲线的陡峭程度可以看出,提取时间对沙棘中黄酮得率影响要高于提取温度,且当提取时间和提取温度之间有一定的拮抗作用,提取时间会限制提取温度对沙棘黄酮得率的影响。从图3c可以看出,提取时间和料液比(D)之间也有一定的拮抗作用,当提取时间较小且料液比过大时,沙棘黄酮得率会明显增加。图3f中,乙醇体积分数(C)和料液比之间也存在拮抗作用,随着乙醇体积分数的过高的乙醇体积分数反而会影响沙棘黄酮得率,限制了料液比增加对沙棘黄酮得率的影响。

图3 两因素相互作用对沙棘黄酮提取率影响的响应面图Fig.3 Response surface diagram of the effect of two factors on the extraction rate of seabuckthorn flavonoids

2.2.4 验证试验 结合响应面模型分析结果,利用软件Design-Expert 8.0.6对所求极值与边界值分析可得出沙棘总黄酮提取工艺的最佳参数为:提取时间23.16 min、提取温度79.95 ℃、乙醇体积分数48.62%、料液比1∶20,在此工艺条件下,沙棘黄酮得率为2.329 mg/g。考虑到提取沙棘黄酮工艺的可操作性,将提取参数修正为:提取时间为23 min、提取温度为80 ℃、乙醇体积分数为50%、料液比为1∶20。以此工艺条件进行3次验证试验,得到沙棘黄酮提取率分别为:2.295 mg/g、2.315 mg/g、2.338 mg/g,与模型所得理论值平均误差仅为0.5%,说明该数学模型能够很好的模拟沙棘中黄酮类化合物的提取工艺。

2.3 沙棘黄酮抗氧化能力的测定

2.3.1 DPPH自由基的清除能力 人体机能通过代谢会产生大量自由基,自由基会对生命大分子如蛋白质、核酸等进行攻击,从而影响身体健康[29]。如果体内的自由基过多,则可引起某些疾病,如肿瘤,心脑血管疾病等等,并且已有科学研究证明人体衰老和自由基引起的氧化损伤有关,其中DPPH自由基,是一个很稳定的自由基,在实验室研究中常被用于抗氧化成分的体外抗氧化性测定[30]。由图4可知,沙棘黄酮粗提取物与VC对照品对DPPH自由基的清除作用呈明显的量效关系,并且呈现出相同的上升趋势,沙棘黄酮粗提取物和VC的浓度越高,对DPPH自由基的清除效果越佳,当沙棘总黄酮粗提取物浓度达到5 mg/mL时,对羟自由基的清除率达到了87.5%,说明沙棘黄酮有较强的抗氧化能力。

图4 沙棘黄酮对DPPH自由基清除能力的影响Fig.4 Effect of sea-buckthorn flavonoids on DPPH free radical scavenging ability

2.3.2 羟自由基的清除能力 羟自由基有着极强的毒性,是最活泼的自由基,羟自由基作用于人体内的核酸、蛋白质、脂类等生物大分子,易对其细胞组织结构和功能造成一定的损伤,造成各类疾病的发生以及机体衰老,影响人体的健康[31]。黄酮类物质抗氧化作用的实现主要是通过酚羟基与自由基反应,形成一种稳定共振的半醌式自由基来阻断氧化链式反应[32]。由图5可知,沙棘黄酮粗提取物和Vc浓度越高,对羟自由基的清除效果越佳,当沙棘总黄酮粗提取物质量浓度达到5 mg/mL时,对羟自由基的清除率达到了77.7%,说明本试验中得到的沙棘黄酮具有较好的抗氧化作用。

图5 沙棘黄酮对羟自由基清除能力的影响Fig.5 Effect of sea buckthorn flavonoids on hydroxyl radical scavenging ability

3 结论

采用沙棘粉末作为原料,乙醇溶液作为提取剂,并与超声波辅助提取技术相结合的方法,分别就提取时间(A)、提取温度(B)、乙醇体积分数(C)和料液比(D)等4个因素进行单因素试验,确定最佳因素水平为提取时间20 min、提取温度70 ℃、乙醇体积分数50%、料液比1∶25 g/mL。响应面试验结果表明,影响沙棘黄酮得率的因素顺序为D>C>A>B,即料液比>乙醇体积分数>提取时间>提取温度,最优工艺参数为:提取时间为23 min、提取温度为80 ℃、乙醇体积分数为50%、料液比为1∶20,在此条件下黄酮得率为2.316 mg/g。

沙棘黄酮粗提取物的抗氧化活性研究表明沙棘黄酮对DPPH自由基和羟自由基都具有较好的清除效果,当沙棘总黄酮粗提取物质量浓度达到5 mg/mL时,对DPPH自由基和羟自由基的清除率分别达到87.5%和77.7%。