水稻愈伤组织诱导及不定芽分化培养体系建立

唐靖雯, 钱晶晶, 王 宁, 曹柳晴, 洪文静, 张从宇

(安徽科技学院,安徽 凤阳 233100)

水稻(Oryzasativa.L)是人类重要的粮食作物之一[1-2],养育了全球超过1/2的人口。60多年来,中国科学家们围绕水稻高产目标,通过一系列的品种选育与应用推广,极大地提高了水稻的产量,为保障中国和世界粮食安全做出了巨大的贡献[3]。如今,随着生物技术的快速发展,中国水稻育种技术迎来新的挑战和机遇。传统育种面临水稻产量低、抗性差等问题[4]。水稻育种技术的深入研究和基因组学技术的进步为水稻育种提供了新的思路[5-6]。因此,采用传统育种和分子育种结合的方法,可以快速、准确地鉴定品种基因型,在保证其原有优良性状的基础上实现多基因聚合选育,从而获得高产、稳定、优质、多抗等优良性状的水稻新品种,以满足未来市场的需求。

但水稻分子育种依然面临许多技术问题[7],其中建立高效的再生体系是实现分子育种的必要前提[8]。水稻再生体系受基因型、外植体类型、基本培养基、植物生长物质和培养条件(光周期和温度)等诸多因素影响[9]。目前,有关水稻组织培养已有相关报道[10-11],但存在分化率低、不定芽生长能力弱等问题[12]。因此,如何提高水稻的组培再生能力成了亟待解决的问题。

本研究以‘润珠香占’成熟胚为外植体,探究不同培养基以及植物生长物质浓度配比对愈伤组织和不定芽诱导的影响,建立高效水稻愈伤组织诱导与不定芽分化培养体系,以期为水稻的快繁提供参考,同时为优良品种选育、遗传转化及基因功能研究等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻品种为‘润珠香占’,由湖北中香种业科技股份有限公司提供。选取饱满的成熟胚为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒 挑选饱满成熟水稻种子,手工剥去颖壳,用自来水冲洗30 min,在超净工作台上用无菌水冲洗4次,75%乙醇浸泡30 s,0.1% HgCl2消毒8 min,再用无菌水冲洗4～6次。将成熟胚接种于不同类型的培养基中,置于(25±2) ℃温度下、光周期为12 h/d、光照为1 500～2 000 lx、相对湿度为60%～70%的培养室中进行培养。

1.2.2 不同培养基类型对愈伤的诱导 每种培养基(N6、B5、MS、WPM)内加入30.0 g/L蔗糖和6.0 g/L琼脂,pH调至6.0±0.2,加入2.0 mg/L 2,4-D、0.1 mg/L VB8、1.0 mg/L VB1、1.0 mg/L VB6,放入高压灭菌锅中121 ℃下灭菌20 min。在超净工作台上将成熟胚放进培养基中,共4种类型的培养基,每种培养基处理7瓶,每瓶接入成熟胚3个,15 d后,观察水稻种子成熟胚出愈情况并记录数据。

1.2.3 不同浓度2,4-D对愈伤组织的诱导 以N6为基本培养基,加入30.0 g/L蔗糖、6.0 g/L琼脂、pH调至6.0±0.2,加入0.1 mg/L VB8、1.0 mg/L VB1、1.0 mg/L VB6后,分别加入6种不同质量浓度2,4-D(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L),放入高压灭菌锅中121 ℃下灭菌20 min,在超净工作台上完成接种工作。共6个梯度,每个浓度重复3次,每个浓度梯度接种5瓶,每瓶3个接入愈伤组织。接种完成后,置黑暗条件下36 d,观察记录并计算诱导率。

1.2.4 不同植物生长物质浓度配比对愈伤组织不定芽的分化 将分化能力强的愈伤组织接种至N6+30.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂,pH调至6.0±0.2,加入0.1 mg/L VB8、1.0 mg/L VB1、1.0 mg/L VB6后,加入8种不同浓度的6-BA、KT、NAA,放入高压灭菌锅中121 ℃下灭菌20 min。在超净工作台上选取生长状态良好的愈伤组织为外植体,接至不同浓度6-BA、KT、NAA的培养基中。共8组处理,每组3次重复。32 d后统计数据并计算愈伤分化率。

1.3 试验数据处理

使用SPSS软件对数据进行单向方差分析、双向方差分析和邓肯多重范围检验,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同培养基类型对愈伤诱导的影响

由表1可知,培养15 d后, B5、MS与N6培养基差异不显著,WPM与N6、B5、MS培养基差异显著。且N6培养基诱导的愈伤组织为淡黄色,分化能力强。因此,N6为水稻愈伤组织诱导的最佳培养基。

表1 不同培养基类型对愈伤诱导的影响Table 1 Effects of different media types on callus induction

2.2 不同2,4-D浓度对诱导愈伤组织的影响

由表2可知,不同2,4-D浓度诱导的水稻愈伤组织之间存在显著差异。B4与B1、B2、B3、B5、B6处理组之间存在显著差异; B1、B2、B5、B6与B3处理组之间存在显著差异;B5和B6处理组之间差异不显著。因此,水稻愈伤组织诱导适宜的2,4-D浓度为2.0 mg/L。

表2 不同2,4-D浓度对愈伤组织诱导的影响Table 2 Effects of different 2,4-D concentrations on callus induction

2.3 不同植物生长物质浓度配比对愈伤组织不定芽分化的影响

将愈伤组织切成0.5 cm2的小块接至分化培养基中,培养20 d后愈伤组织长出嫩绿色小芽,32 d左右长出肉眼可见的嫩芽(见图1)。由表3可知,T5处理组与其他处理组存在显著差异;T7与T1、T2、T3、T4、T6、T8处理组之间差异显著;T6与T1、T3、T8处理组之间差异不显著。当NAA浓度为0.5 mg/L时,愈伤组织分化率较低,且丛生芽生长情况由黄色逐渐变为褐色,甚至死亡;但随着NAA浓度增加至1.0 mg/L时,愈伤组织分化率显著高于0.5 mg/L;当其为1.0 mg/L时,加入1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L KT,愈伤分化率为71.67%;而加入1.0 mg/L 6-BA和2.0 mg/L KT,愈伤组织分化不定芽的能力较弱,低于50%。因此,当6-BA、KT、NAA的浓度为1∶1∶1时,愈伤组织分化不定芽能力强。

图1 水稻愈伤组织的诱导及不定芽分化培养生长过程Fig.1 Induction of rice callus and growth process of adventitious bud differentiation culture注:A为N6培养基中成熟胚诱导的愈伤组织(15 d);B为愈伤组织生长情况(36 d);C为愈伤组织诱导的不定芽生长情况(32 d);D为愈伤组织诱导的不定芽生长情况(50 d)。

表3 不同植物生长物质浓度配比对愈伤组织从生芽分化的影响Table 3 Effects of different plant growth substance concentrations and proportions on callus differentiation from buds

3 结论与讨论

本试验通过对培养基类型、植物生长物质浓度等对水稻组织培养过程的影响进行筛选得出,N6为诱导水稻愈伤组织的最佳培养基,出愈率达到100%。最佳培养基配方为N6+30.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂+2.0 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L VB8+1.0 mg/L VB1+1.0 mg/L VB6,诱导出的愈伤组织结构紧实、颜色微黄,适于诱导分化苗。在探讨不同植物生长物质浓度比例对水稻愈伤组织不定芽分化的影响中,当6-BA、KT、NAA的质量浓度比为1∶1∶1时,愈伤组织分化率达到71.67%,即最佳培养基配方为N6+30.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L NAA+2.0 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L VB8+1.0 mg/L VB1+1.0 mg/L VB6。本研究建立了水稻愈伤组织诱导及不定芽分化培养体系,为水稻育种奠定了研究基础。

通过试验得出,不同培养基对水稻组织培养具有一定的影响。以成熟胚为外植体,采用N6、B5、MS培养基为主。本研究得出,N6较其他培养基而言,对水稻愈伤组织的诱导有着积极的作用。张玲等[13]在水稻组织培养研究中表明N6对愈伤组织诱导有较好的促进作用;本研究结果与张智奇等[14]、袁云香等[15]研究结果一致。

研究表明,植物生长物质在植物组织培养中起着较大的作用[16-17]。本试验中2.0 mg/L 2,4-D愈伤组织诱导为100%,与阎丽娜等[18]研究结果相同。郭晓丽等[19]研究同样表明加2.0 mg/L 2,4-D可提高愈伤组织的诱导率,与本研究结果相同。生长素和细胞分裂素共同作用对于诱导不定芽的分化和生长有着积极的作用[20]。本试验NAA是重要的激素之一,同时配以6-BA、KT效果较好,与朱克明等[21]所用的激素名称一致,具体浓度不一致,可能是因为不同水稻品种对激素的耐受能力及敏感性不同。