血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平对慢性肾小球肾炎患者预后的预测价值

黄其峰,童薇,刘洋,江小伟,刘萍

慢性肾小球肾炎是双侧肾小球弥漫或局部发生炎性反应的肾小球免疫损伤性疾病[1]。若治疗不及时,易发展为肾功能衰竭[2]。因此临床上急需可靠的慢性肾小球肾炎预后评估指标。以往研究发现,微小RNA(miR)-181a-5p、miR-132-5p均与炎性反应有关,可抑制神经炎性反应,延缓神经功能减退的进展[3-5]。肾小球肾炎早期病变为系膜细胞增殖等,Liang等[6]研究显示,在高糖处理的肾小球系膜细胞中miR-181a-5p表达显著下降,miR-181a-5p过表达能抑制肾小球系膜细胞增殖,并降低白介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。孙枫等[7]报道显示,在高糖处理的肾小球系膜细胞中miR-132-5p表达显著下调,miR-132-5p过表达可显著促进高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡,并降低IL-6和TNF-α水平。但目前并无miR-181a-5p和miR-132-5p在慢性肾小球肾炎中的相关报道,因此本研究拟探讨慢性肾小球肾炎患者血清miR-181a-5p和miR-132-5p水平以及二者与预后的关系,旨在为减少慢性肾小球肾炎不良预后的发生提供参考,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月—2020年4月中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院肾内科收治的慢性肾小球肾炎患者128例作为慢性肾小球肾炎组(肾炎组),男73例,女55例,年龄30～75(55.21±10.11)岁;体质量指数(BMI)18.61～25.04(22.71±3.79)kg/m2;病理类型:IgA系膜增生性肾小球肾炎47例,非IgA系膜增生性肾小球肾炎34例,系膜毛细血管性肾小球肾炎16例,膜性肾病22例,局灶节段性肾小球硬化9例。选取同期医院体检健康者130例作为健康对照组(对照组),男67例,女63例,年龄29～72(54.95±10.28)岁;BMI为18.52～24.76(22.45±3.64)kg/m2。2组人员的性别、年龄、BMI比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究通过医院伦理委员会批准(LCL审第20170069号),受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①患者均符合慢性肾小球肾炎的诊断标准[8],经肾穿刺活检证实,且为初次确诊;②年龄>18岁且肝功能正常;③病例资料完整且配合随访。(2)排除标准:①合并肿瘤患者;②合并严重肝功能障碍患者;③合并严重感染性疾病、泌尿系统感染患者;④近6个月使用肾毒性药物患者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清miR-181a-5p、miR-132-5p表达检测:患者入院后翌日清晨、健康者体检时采集空腹肘静脉血7 ml,离心留取血清,保存在-70℃冰箱中。使用血清总RNA纯化试剂盒(批号WH9042,购自扬州万禾生物科技公司)提取样品中总RNA,用10 ng总RNA依照逆转录试剂盒(批号WH2730,购自扬州万禾生物科技公司)反转录cDNA。采用实时荧光定量PCR仪(型号Pangaea,购自北京深蓝云生物科技公司)对miR-181a-5p、miR-132-5p及内参U6进行扩增反应,miR-181a-5p上游引物:5'-GGAGAACATTCAACGCTGT-3',下游引物:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3';miR-132-5p上游引物:5'-ACCGTGGCTTTCGATTGTTACT-3',下游引物:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';U6上游引物:5'-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3',下游引物:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。引物由上海生工合成。反应条件:95℃ 5 min、 95℃ 19 s、62℃ 22 s、72℃ 23 s,共计36个循环。对miR-181a-5p、miR-132-5p相对表达量用2-△△CT法计算。

1.3.2 肾功能指标检测:取血清样本,全自动生化分析仪(型号BX-3010,购自日本希森美康公司)检测尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平;并计算肾小球滤过率(eGFR)[9]。酶联免疫吸附法测定胱抑素C(CysC)水平,试剂盒批号GH-29346,购自南昌和利思生物技术公司。

1.3.3 随访:慢性肾小球肾炎患者治疗后随访3年,起始日期为患者治疗后出院当日,随访截止日期为出院当日后第3年。根据患者病情进展情况分为:预后不良亚组26例病情进展为终末期肾病,即eGFR<15 ml·min-1·1.73 m-2),预后良好亚组(病情无进展,未发展为终末期肾病)102例。

2 结 果

2.1 2组血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平比较 与对照组比较,肾炎组血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平显著降低(P<0.05),见表1。

表1 对照组和肾炎组血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平比较Tab.1 Comparison of serum miR-181a-5p and miR-132-5p levels between the control group and the nephritis group

2.2 2组肾功能指标比较 与对照组比较,肾炎组患者血清UA、BUN、SCr、CysC水平显著升高(P<0.01),eGFR水平显著降低(P<0.01),见表2。

表2 对照组和肾炎组肾功能指标比较Tab.2 Comparison of renal function indicators between the control group and the nephritis group

2.3 血清miR-181a-5p、miR-132-5p与肾功能指标的相关性分析 慢性肾小球肾炎患者血清miR-181a-5p与miR-132-5p水平呈正相关(P<0.01);血清miR-181a-5p和miR-132-5p均与UA、BUN、SCr、CysC水平呈负相关(P<0.01),与eGFR水平呈正相关(P<0.01),见表3。

表3 慢性肾小球肾炎患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p与肾功能指标的相关性分析Tab.3 Correlation analysis between serum miR-181a-5p, miR-132-5p and renal function indicators in patients with chronic glomerulonephritis

2.4 2亚组患者临床资料、肾功能指标及血清miR-181a-5p、miR-132-5p比较 与预后良好亚组比较,预后不良亚组患者性别、年龄、BMI、病理类型比较差异无统计学意义(P>0.05),血清UA、BUN、SCr、CysC水平显著升高(P<0.01),eGFR及血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平显著降低(P<0.01),见表4。

表4 预后良好亚组和预后不良亚组患者临床资料、肾功能指标及血清miR-181a-5p、miR-132-5p比较Tab.4 Comparison of clinical data, renal function indicators, and serum miR-181a-5p and miR-132-5p between patients with good and poor prognosis subgroups

2.5 影响慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的多因素Logistic回归分析 以慢性肾小球肾炎患者3年内是否发生预后不良为因变量(0=未发生,1=发生),以UA、BUN、SCr、CysC、eGFR、miR-181a-5p、miR-132-5p水平(均是连续变量)为自变量进行多因素Logistic回归分析,结果发现:高水平UA、高水平BUN、高水平SCr、高水平CysC、低水平eGFR、低水平miR-181a-5p、低水平miR-132-5p是影响慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的危险因素(P<0.05),见表5。

表5 影响慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的多因素Logistic回归分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of poor prognosis within 3 years in patients with chronic glomerulonephritis

2.6 血清miR-181a-5p、miR-132-5p预测慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的价值 绘制血清miR-181a-5p、miR-132-5p及二者联合预测慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的ROC曲线,结果显示,血清miR-181a-5p、miR-132-5p二者联合预测慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的AUC分别为0.832、0.801、0.904,二者联合预测的AUC显著高于血清miR-181a-5p、miR-132-5p各自单独预测AUC(Z=1.714、2.050,P=0.043、0.020),见图1、表6。

图1 血清miR-181a-5p、miR-132-5p及二者联合预测慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的ROC曲线Fig.1 ROC curve of serum miR-181a-5p, miR-132-5p, and their combination predicting poor prognosis within 3 years in patients with chronic glomerulonephritis

表6 血清miR-181a-5p、miR-132-5p预测慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的价值Tab.6 Value of serum miR-181a-5p and miR-132-5p in predicting poor prognosis within 3 years in patients with chronic glomerulonephritis

3 讨 论

慢性肾小球肾炎若治疗不及时,病情容易发展为慢性肾衰竭[10-11]。尽管肾活检在诊断各种肾脏疾病方面有极大作用,但这种侵入性操作有时会导致出血,尤其在老年患者中出血可能是致命的[12-13]。因此,临床上寻求预测慢性肾小球肾炎预后的生物标志物对于改善患者生存期方面是必要的。

慢性肾小球肾炎发病机制尚不明确，有研究显示其发病机制可能由免疫相关的细胞因子介导,各种细胞因子相互调节,共同参与炎性反应[14]。miRNAs是短的非编码RNA(17～22个核苷酸),可以转录后调控相关基因的表达,阻止信使RNA(mRNA)翻译或促使mRNA降解[15]。Zhang等[16]研究表明,脂多糖(LPS)诱导的人肾小管上皮细胞系(HK-2)细胞IL-1β和TNF-α等炎性因子均升高,进一步研究发现,miR-181a-5p高表达可抑制LPS诱导的HK-2细胞焦亡,从而抑制细胞炎性反应。Cao等[17]报道,人HK-2细胞用转化生长因子-β1处理可在体外模拟肾纤维化,而提高miR-181a-5p活性可抑制HK-2细胞肾纤维化的进展。Xu等[18]发现,高糖诱导的HK-2细胞中miR-181a-5p表达下降,并通过增强纤连蛋白和胶原蛋白I的表达,以促进HK-2细胞肾纤维化。miR-132-3p已成为慢性炎性疾病的介质,Fang等[19]报道,miR-132-3p的表达增强会减轻巨噬细胞的炎性应激反应和M1极化。陈刚等[20]发现,血管平滑肌细胞经氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)诱导后miR-132-5p表达水平显著下降,增强miR-132-5p活性可使得oxLDL诱导的血管平滑肌细胞中炎性因子水平下降。高继英等[21]研究表明,miR-132-5p过表达可抑制炎性反应和细胞凋亡,从而减轻帕金森细胞模型损伤。本研究发现,慢性肾小球肾炎患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平显著低于健康人,与上述研究的结果相似[16-20],提示miR-181a-5p、miR-132-5p可能参与慢性肾小球肾炎疾病的发生。本研究进一步发现预后不良慢性肾功能衰竭患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平明显低于预后良好患者,提示miR-181a-5p、miR-132-5p可能影响慢性肾小球肾炎患者预后情况,推测miR-181a-5p、miR-132-5p可能通过调控肾血管内皮细胞平滑肌细胞活力和炎性反应从而影响患者预后。本研究还发现,低水平miR-181a-5p、miR-132-5p是影响慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的危险因素,且血清miR-181a-5p、miR-132-5p预测慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的AUC分别为0.832、0.801,提示其对于预估慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良有一定帮助,临床上要监控miR-181a-5p和miR-132-5p低水平患者,及时给予治疗,以改善预后。

临床上评价肾功能损害常通过检测肾小管重吸收和排泄功能及肾小球滤过率,常用指标有UA、BUN、Scr、CysC及eGFR等[22]。本研究发现慢性肾小球肾炎患者血清UA、BUN、SCr、CysC水平显著高于健康人,eGFR显著低于健康人;3年内预后不良患者血清UA、BUN、SCr、CysC水平较预后良好患者更高,eGFR水平较预后良好患者更低;提示慢性肾小球肾炎患者肾功能存在损害,且患者肾功能越差其预后不良的可能性越高。慢性肾小球肾炎患者血清miR-181a-5p与miR-132-5p水平呈正相关,血清miR-181a-5p和miR-132-5p均与UA、BUN、SCr、CysC水平呈负相关,与eGFR水平呈正相关,表明miR-181a-5p和miR-132-5p可能存在相互作用,共同影响患者肾功能,从而影响患者预后。ROC曲线分析还显示,血清miR-181a-5p和miR-132-5p联合预测慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的AUC为0.904,优于二者各自单独预测,提示二者联合预估患者3年内预后效果可能更好。

综上所述,慢性肾小球肾炎患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平较低,二者与肾功能关系密切,miR-181a-5p、miR-132-5p低水平可能会导致患者3年内预后不良,二者联合有助于评估患者3年内预后情况。本研究的不足之处在于未探究血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平对慢性肾小球肾炎患者长期预后的影响,后期将扩大样本量,采用多中心研究的方式,进一步探究二者对患者长期预后的作用。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

黄其峰:设计研究方案,课题设计,实施研究过程,论文撰写;童薇:提出研究思路,分析试验数据,论文审核;刘洋、江小伟:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;刘萍:进行统计学分析