白菜型油菜BrBBX家族的鉴定与BrBBX46和BrBBX53基因的胁迫响应分析

皮博艺 聂治 杜文平 余桂容 甘雨 宋军

摘要：BBX是一类重要的锌指蛋白转录因子家族，包含1～2個高度保守位于蛋白质序列N端的BBX结构域，在调控植物的生长发育和响应环境胁迫中发挥着重要作用。利用生物信息学分析手段，在白菜型油菜中鉴定出59个BrBBX家族成员，对它们的染色体定位、基因结构、蛋白保守结构域，以及BrBBX46和BrBBX53基因的启动子进行了分析，并用qRT-PCR技术鉴定了BrBBX46和BrBBX53基因在模拟干旱和盐胁迫下的表达水平。结果显示，59个BrBBXs不均匀地分布于白菜型油菜基因组的10条染色体。通过对系统进化、基因结构、蛋白保守 结构域的分析，59个BrBBXs被分为5个亚族，每个亚族的基因结构、蛋白结构域和保守基序均相对保守，同一亚族的成员具有相似的基因结构和保守结构域。对启动子的分析结果显示，BrBBX46和BrBBX53基因的启动子中均含有大量的胁迫相关响应元件，尤其是干旱胁迫响应元件，二者均有14个；在40% PEG和120 mmol/L NaCl处理下，二者的表达水平均显著上升，说明BrBBX46和BrBBX53基因能够响应干旱和盐胁迫的诱导，可能在干旱和盐胁迫下发挥着重要功能。以上结果为进一步了解和利用BrBBX家族成员改良白菜型油菜耐旱耐盐新品种提供了良好的基因资源。

关键词：白菜型油菜；BBX家族；BrBBX46；BrBBX53；生物信息学；胁迫响应

中图分类号：S565.4              文献标志码：A             文章编号：2097-2172（2024）01-0026-011

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.01.005

Identification of the BBX family in B. rapa and Stress Response

Analysis of BrBBX46 and BrBBX53 Genes

PI Boyi， NIE Zhi， DU Wenping， YU Guirong， GAN Yu， SONG Jun

（Institute of Biotechnology & Nuclear Techniques， Sichuan Academy Agricultural Sciences， Chengdu Sichuan 610066， China）

Abstract： BBX is an important family of zinc finger protein transcription factors， containing one to two highly conserved BBX domains located at the N terminus of the protein sequence. It plays an important role in regulating plant growth and development and responding to environmental stress. In this study， 59 BrBBX family members were identified in B. rapa by bioinformatics analysis，and their chromosome location， gene structure， protein conserved domain， and promoters of BrBBX46 and BrBBX53 genes were analyzed. The expression levels of BrBBX46 and BrBBX53 were determined by qRT-PCR under simulated drought and salt stress. The result showed that 59 BrBBXs were unevenly distributed on 10 chromosomes of the B. rapa genome. Based on the analysis of phylogenetic evolution， gene structure and protein conserved domains， 59 BrBBXs were divided into five subfamilies. The gene structure， protein domain and conserved motifs of each subfamily were relatively conserved， and members of the same subfamily had similar gene structure and conserved domains. The results of promoter analysis showed that the promoters of BrBBX46 and BrBBX53 contained a large number of stress-related response elements， especially drought stress response elements， and there were 14 drought stress response elements in BrBBX46 and BrBBX53， respectively. The expression levels of BrBBX46 and BrBBX53 were significantly increased under the treatment of 40% PEG and 120 mM NaCl， indicating that BrBBX46 and BrBBX53 can respond to the induction of drought and salt stress and may play important functions under drought and salt stress. These results provide good gene resources for further understanding of BrBBX family and using BrBBX family members to improve the drought and salt tolerant new varieties of B. rapa.

Key words： B. rapa; BBX family; Identification; BrBBX46; BrBBX53; Bioinformation; Stress response

转录因子（Transcription factor， TF）又称反式作用因子，是一种DNA结合蛋白，通过与靶基因的特定顺式元件相互作用，激活或抑制下游基因的表达［1 ］。转录因子在植物生长发育、光周期调控、响应生物胁迫（如细菌、真菌和病毒攻击）以及非生物胁迫（干旱、盐、高渗透压、热或寒冷）中发挥重要作用［2 - 4 ］。

锌指蛋白（Zinc Finger Protein， ZFP）是植物应对逆境的重要转录因子，B-Box（BBX）型锌指蛋白包含1～2个位于N端的BBX结构域（C-X2-C-X8- C-X7-C-X2-C-X4-H-X8-H），也有一些BBX家族成员在C端包含一个CCT结构域［5 ］。BBX结构域可分为2种类型：BBX1和BBX2；CCT结构域由42～43个氨基酸组成，对转录和核蛋白转运具有重要作用［6 - 7 ］。Khanna等［5 ］在拟南芥中鉴定出32个BBX蛋白，并根据AtBBX蛋白成员的BBX结构域和CCT结构域是否存在，将它们分为5个亚族，分别为第Ⅰ亚族、第Ⅱ亚族、第Ⅱ亚族、第Ⅳ亚族和第Ⅴ亚族，其中第Ⅰ亚族和第Ⅱ亚族均包含2个BBX结构域和1个CCT结构域，第Ⅲ亚族包含1个BBX结构域和1个CCT结构域，第Ⅳ亚族包含2个BBX结构域，而第Ⅴ亚族仅包含1个BBX结构域。随着对BBX基因家族功能的研究，BBX型锌指蛋白家族在其他植物中也被鉴定，如水稻、玉米、大豆、茶树、巨桉、马铃薯等植物中分别有30、36、42、31、21、30个BBX成员［8 - 13 ］。近年来，BBX家族成员在植物光形态形成、开花调控、激素信号转导和非生物胁迫中均有报道［2， 14 - 17 ］。

在拟南芥中，多数BBX家族基因的功能已被报道，第1个被发现的拟南芥BBX成员CO （CONSTANS）在开花过程中发挥作用［18 ］。AtBBX4（COL1）和AtBBX20-22能够促进根的伸长，在光响应途径中起着调控因子的作用，促进拟南芥幼苗的光形态建成。也有一些BBX成员在拟南芥幼苗光形态建成过程中发挥相反的功能，如AtBBX18、AtBBX19、AtBBX25和AtBBX32在拟南芥光形态建成过程中作为负调控因子，抑制幼苗的光形态建成［19 ］。水稻中拟南芥CO的同源蛋白Hd1（OsBBX家族蛋白）在光响应途径中调控水稻的花期，在短日照条件下能够促进水稻开花［20 ］。拟南芥CO蛋白在水稻中的同源蛋白OsCOL9能正向调控抗原细胞抗性，敲除水稻OsCOL9基因可增加水稻的产量，提高转基因水稻植株对稻瘟病菌的敏感性，使稻瘟病菌感染的可能性增大［21 ］。AtBBX20、AtBBX18和AtBBX16分别参与了油菜素内酯（BR）、赤霉酸（GA）和生长素信号的转导［22 - 24 ］。

BBX成员除了参与植物的生长发育，还参与了非生物胁迫响应，AtBBX24在拟南芥耐盐性调控中起着调控因子的作用，过表达AtBBX24基因能够增强拟南芥植株的耐盐性［16 ］；AtBBX5能够响应干旱和盐的诱导，通过增强ABA的生物合成以及胁迫响应基因的表达增强拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受能力［25 ］；AtBBX18通过调控热休克应答基因（HSP）参与了拟南芥植株对热胁迫的耐受性的调控［17 ］。Yang等［26 ］在菊花（Chrysanthemum morifolium）中证明了CmBBX24可以提高植物对低温和干旱的耐受性水平，Liu等［27 ］进一步在拟南芥中异源表达菊花CmBBX22基因，发现其能显著延缓拟南芥叶片衰老、增强植株耐旱性。苹果MdBBX10在拟南芥中异位表达增强了转基因拟南芥植株的耐盐性和耐旱性［28 ］。

白菜型油菜（Brassica rapa， 2n=20， AA）是研究多倍体进化的模式生物，是甘蓝型油菜（B. napus，2n=38， AACC）A基因组的提供者，也是重要的经济作物。目前在水稻、玉米、大豆、马铃薯等作物中已鉴定出BBX家族成员［8 - 10， 13 ］，而白菜型油菜的BBX家族的鉴定还未见报道。为此，本研究通过生物信息学分析方法和手段，在全基因组范围内鉴定了白菜型油菜的BBX家族成员，分析了BrBBX家族的染色体分布、系统进化关系、基因结构、蛋白结构与保守基序以及BrBBX46和BrBBX53基因对干旱胁迫和盐胁迫的响应，以期为深入研究BrBBX基因家族的功能和耐盐耐旱新品种的改良提供理论参考。

1   材料与方法

1.1   供试植物材料及培养条件

白菜型油菜在温度24±1℃、光照强度100 μmol /（m2·s）、空气湿度60%～70%、光周期为16 h光照/8 h黑暗的植物生長室中进行培养。

1.2   白菜型油菜BrBBX蛋白家族的鉴定

根据拟南芥AtBBX家族蛋白序列［5 ］，在白菜型油菜数据库（http：//brassicadb.cn/#/）中，利用BLASTp工具查找白菜型油菜BBX蛋白序列，随后在http：//smart. embl-heidelberg.de/和https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi上进行鉴定，含有1个或2个BBX结构域的蛋白为白菜型油菜BBX家族成员。

1.3   BrBBX基因在染色体上的分布

从白菜型油菜数据库中获取BrBBX成员的基因号及其在染色体上的位置信息，利用Mapchart 2.2软件绘制BrBBX成员在染色体上的分布图。

1.4   BrBBX基因家族系统发育进化树的构建

根据已报道的拟南芥和水稻BBX蛋白序列，结合在数据库下载的白菜型油菜BBX家族成员蛋白序列，在MEGA7软件中采用邻近法（Neighbor-Joining， NJ）绘制BrBBX基因家族系统发育进化树，校验参数Bootstrap Replications设置为1000。

1.5   BrBBX家族的基因结构、蛋白保守结构域和保守基序分析

从数据库下载白菜型油菜BBX家族成员DNA序列和CDS序列，利用在线软件GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）分析外显子、内含子的数目及位置。利用从数据库获取的白菜型油菜BBX家族成员的蛋白序列，通过在线软件Multiple Em for Motif Elicitation（MEME， https：//meme-suite.org/meme/ tools/meme）绘制BrBBX成员保守结构域图，分析BrBBX家族成员保守序列。

1.6   拟南芥BBX24同源基因BrBBX46和BrBBX53的胁迫响应分析

在数据库下载AtBBX24在白菜型油菜中同源基因BrBBX46和BrBBX53起始密码子上游2 000 bp序列，作为BrBBX46和BrBBX53基因的启动子进行分析。利用PlantCARE在线工具对BrBBX46和BrBBX53基因启动子中的响应元件进行分析［29 ］。

为了研究AtBBX24在白菜型油菜中的同源基因BrBBX46和BrBBX53对干旱胁迫和盐胁迫的响应，首先用75%乙醇清洗白菜型油菜种子3～5 min，再用去离子水漂洗3遍后浸种3～4 h，随后播种于装有湿润的营养土、蛭石（体积比为1∶1）的小花钵中，在4 ℃条件下低温处理48 h后置于生长室培养。待白菜型油菜植株生长至2片真叶完全展开时，用120 mmol/L NaCl和40% PEG处理12 h，之后分别取对照条件（未胁迫）、120 mmol/L NaCl 和40% PEG处理下的样品各3份，液氮速冻，-80 ℃条件下保存。

根据Huang等［30 ］的方法，用Trizol试剂［Sangon Biotech （Shanghai） Co.， Ltd.］抽提白菜型油菜总RNA，然后利用超微量分光光度计（NanoDrop 2000， Thermo Fisher Scientific， USA）测量RNA质量和浓度，使用反转录试剂盒［Hifair■ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（gDNA digester plus），Yeasen Biotech（Shanghai） Co.， Ltd.］将1 ug RNA反转为cDNA，以BraA02g003190（BrACTIN）为内参基   因［31 ］，利用qRT-PCR技术对BrBBX46和BrBBX53的表达量进行鉴定，引物序列见表1。最后采用2-ΔΔCT法计算BrBBX46和BrBBX53基因在干旱和盐胁迫处理下的表达水平［32 ］。

2   结果与分析

2.1   BrBBX基因家族的染色体定位分析

利用拟南芥AtBBX家族蛋白序列，在白菜型油菜数据库共筛选鉴定到59个BrBBX基因家族成员。根据白菜型油菜数据库公布的染色体位置信息，利用MapChart 2.2 软件绘制BrBBX家族基因的染色体定位图谱（图1）。

从图1可知，白菜型油菜的基因组共10条染色体：Chr01～Chr10。其中Chr09染色体最长（45.2 M），Chr03染色体次之（38.1 M）；长度最短的是Chr10染色体，只有20.7 M，有5个BrBBX基因位于该染色体；BrBBX基因在Chr01和Chr07染色体上最多，均有8个，但Chr07染色体更短，因此，Chr07染色体上BrBBX的基因密度大于Chr01染色体。

2.2   BrBBX蛋白的系统发育进化分析

利用已报道的32个AtBBX蛋白、30个OsBBX蛋白序列和已鉴定的59个BrBBX蛋白进行系统发育分析。结果显示，与拟南芥的聚类结果相似［5 ］，59个BrBBX蛋白被分为第Ⅰ亚族、第Ⅱ亚族、第Ⅲ亚族、第Ⅳ亚族、第Ⅴ亚族（图2）。其中，第Ⅳ亚族有17个BrBBX蛋白，是拥有BrBBX成员最多的亚族；12个BrBBX蛋白被聚类在第Ⅱ亚族；第Ⅲ亚族是最小的一个亚家族，仅包含6个BrBBX蛋白，位于该亚族的还有4个AtBBX和3个OsBBX；第Ⅰ亚族包含9个BrBBX，第Ⅴ亚族包含15个BrBBX。与拟南芥和水稻不同的是，在第Ⅴ亚族中，拟南芥7个BBX成员和水稻中3个BBX成员均聚类在同一个小亚族，而在白菜型油菜中BrBBX被分为了2个小亚族：Ⅴ-1和Ⅴ-2，其中Ⅴ-1包括9个BrBBX家族成员，Ⅴ-2包括6个BrBBX家族成员。

2.3   BrBBX家族成员的结构和保守基序分析

白菜型油菜BrBBX家族的基因结构和蛋白保守结构域（图3）显示，聚类于同一亚族的BrBBX成员具有相似的基因结构。除了8个BrBBX成员以外，大多数BrBBX成员的基因组序列在2 kb以下。在第Ⅰ亚族中，BrBBX基因仅有1个或2个外显子；第Ⅱ亚族中，除了BrBBX55有5个外显子以外，其他BrBBX基因的外显子个数均为3～4个；基因组序列最长的基因BrBBX4和序列最短的基因BrBBX3均聚类在第Ⅴ亚族。

为了研究BrBBX蛋白的保守结构域，通過MEME在线工具对59个BrBBX的蛋白保守结构域进行了分析（图3）。发现位于同一亚族的BrBBX成员具有相似的结构域和保守基序：第Ⅰ亚族和第Ⅱ亚族中的BrBBX成员均包含2个BBX结构域（BBX1和BBX2）和1个CCT结构域；第Ⅲ亚族中的BrBBX成员包含1个BBX1结构域和1个CCT结构域；第Ⅳ亚族中的BrBBX成员包含2个BBX结构域（BBX1、BBX2）；第Ⅴ亚族的BrBBX成员仅有1个BBX结构域，不同的是，在拟南芥和水稻中，该亚族中的BBX成员的BBX结构域类型均为BBX1，而在白菜型油菜中，有的BrBBX成员含有BBX1结构域，有的则具有BBX2结构域。对BrBBX家族蛋白的保守结构域基序序列进行分析的结果与前人的报道相似［5 - 7 ］：BrBBX家族中的BBX1和BBX2结构域分别具有保守的C-X2- C-X8-C-X7-C-X2-C和C-X7-C-X2- C-X4-H基序（图4A、图4B），而CCT结构域包含了42～50个氨基酸残基，也具有高度的保守性（图4C）。

2.4   BrBBX46和BrBBX53的胁迫响应分析

早期有研究显示，AtBBX24正调控拟南芥的耐盐性［16 ］。通过系统发育和序列比对分析，在白菜型油菜中鉴定出2个AtBBX24的同源基因BrBBX46和BrBBX53，通过在数据库下载的BrBBX46和BrBBX53基因的启动子序列，对2个基因的启动子元件进行统计分析。分析结果显示，除了核心启动子元件以外，BrBBX46基因的启动子中响应干旱胁迫元件最多，有14个；BrBBX53基因的启动子中光响应的元件数目最多（有17个），其次为干旱胁迫响应元件，与BrBBX46基因一样，也有14个；BrBBX46和BrBBX53基因的启动子中还发现与厌氧胁迫、光、水杨酸、防御和胁迫相关的启动子元件。但响应低温、细胞周期调控、赤霉素和生长素的作用元件仅存在于BrBBX53基因的启动子中（图5A）。上述结果说明BrBBX46和BrBBX53可能与干旱、厌氧等胁迫应答相关，BrBBX53还可能响应低温和植物激素的诱导［33 ］。

利用qRT-PCR技术，鉴定了BrBBX46和BrBBX53基因在模拟干旱和鹽胁迫条件下的表达水平，结果表明，BrBBX46和BrBBX53基因的表达水平受PEG和NaCl诱导均显著上调，与对照未胁迫相比，BrBBX46基因在PEG和NaCl处理下的表达水平上调了6倍左右（图5B）；BrBBX53基因在PEG处理下上调了12倍，在NaCl处理下上调了9倍（图5C）。说明BrBBX46和BrBBX53基因既能响应PEG模拟干旱的诱导，也可能参与NaCl诱导的盐胁迫响应。

3   结论与讨论

在白菜型油菜中共鉴定到59个BrBBX，分布于白菜型油菜基因组的10条染色体。与拟南芥相比，白菜型油菜每个亚族中的BrBBX蛋白数量均介于AtBBX数量的1.50 ～ 2.20倍，说明在进化过程中白菜型油菜BrBBX家族发生了基因复制事件。水稻是单子叶植物进化分析的模式植物，与水稻相比，白菜型油菜每个亚族中的BrBBX蛋白数量是水稻中OsBBX数量的1.28 ～ 5.00倍，这说明了单子叶植物与双子叶植物之间的进化差异。白菜型油菜BBX家族基因在进化上相对保守，聚类于同一亚族的基因具有相似的基因结构与蛋白结构。前人报道拟南芥第Ⅰ亚族和第Ⅱ亚族中的BBX成员均包含2个BBX结构域，并且BBX1结构域位于BBX2结构域之前［5 ］，而本研究发现仅在第Ⅱ亚族中与拟南芥结构域一致。在第Ⅰ亚族中BrBBX蛋白的BBX1结构域在BBX2结构域之后；且在拟南芥中的第Ⅴ亚族中仅发现了BBX1结构域，而在白菜型油菜的第Ⅴ亚族中既发现了BBX1结构域，还发现了BBX2结构域的存在。这可能是在进化的过程中，白菜型油菜的BrBBX家族发生了BBX结构域改变或缺失［34 - 35 ］。

BBX家族基因在响应生物和非生物胁迫方面发挥着重要作用［17， 21 ］。AtBBX24正向调控拟南芥的耐盐性［16 ］，AtBBX5正向调控拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受性［25 ］，AtBBX18负调控拟南芥耐热性［17 ］。通过系统进化分析，从进化保守的BBX结构域未发生改变的第Ⅳ亚族中比对到拟南芥AtBBX24的同源基因：BrBBX46和BrBBX53，对其启动子元件进行了分析，发现这2个BrBBX基因的启动子中含有大量的干旱胁迫响应元件。模拟干旱和盐处理条件下，二者的表达量均显著上调，均能响应干旱和盐胁迫的诱导，说明BrBBX46和BrBBX53与二者在拟南芥中的同源基因AtBBX24相似，均能响应盐胁迫的诱导；BrBBX46和BrBBX53基因启动子中富含的大量干旱胁迫响应元件，也使其在模拟干旱条件下通过上调基因的表达水平来应对干旱胁迫。方宝华等［14 ］的研究表明，水稻中也有部分BBX成员能够响应盐胁迫和干旱胁迫，如OsBBX6、OsBBX7、OsBBX19、OsBBX28等均能响应干旱胁迫，OsBBX1、OsBBX19、OsBBX26、OsBBX28等能响应盐胁迫的诱导。但也有推测：水稻BBX可能不是作为干旱或盐胁迫中的重要因子参与逆境响应。根据系统进化分析，在水稻中BrBBX46和BrBBX53的同源基因是OsBBX4，但在非生物胁迫的表达谱鉴定中，该基因在干旱和盐处理下表达量略有上调，但未达到显著差异，这可能是由于OsBBX4与BrBBX46和BrBBX53的亲缘关系较远，导致了不同物种中同源基因的功能差异化。

本研究利用生物信息学分析手段在白菜型油菜全基因组水平上鉴定到59个BrBBX成员，系统地分析了59个BrBBX的染色体分布、系统发育、基因结构、蛋白保守结构域，以及AtBBX24的同源基因BrBBX46和BrBBX53对干旱胁迫（40% PEG处理）、盐胁迫（120 mmol/L NaCl处理）的响应，并利用qRT-PCR技术鉴定了BrBBX46和BrBBX53基因在模拟干旱胁迫和盐胁迫下的表达水平，结果显示，59个BrBBXs不均匀地分布在白菜型油菜基因组的10条染色体上。通过对系统进化、基因结构、蛋白保守结构域的分析，将59个BrBBXs分为5个亚族，每个亚族的基因结构、蛋白结构域和保守基序都相对保守，同一亚族的成员具有相似的基因结构和保守结构域。启动子的分析结果显示，BrBBX46和BrBBX53基因的启动子中均含有大量的胁迫相关响应元件，尤其是干旱胁迫响应元件，二者均有14个；在40% PEG和120 mmol/L NaCl处理下，二者的表达水平均显著上升，说明BrBBX46和BrBBX53基因能够响应干旱胁迫和盐胁迫的诱导，可能在干旱胁迫和盐胁迫下发挥着重要功能。为了解和研究白菜型油菜基因家族的成员提供了丰富的信息和理论基础，并且为进一步利用BrBBX家族成员改良白菜型油菜耐旱耐盐新品种提供了良好的基因资源。

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收稿日期：2023 - 11 - 20

基金項目：四川省财政自主创新专项（2022ZZCX028）。

作者简介：皮博艺（1993 — ），女，湖南澧县人，助理研究员，博士，主要从事作物分子生物学及遗传育种研究工作。Email： boyipi@163.com。

通信作者：宋   军（1981 — ），男，四川眉山人，副研究员，硕士，主要从事植物诱变及生物育种工作。Email： 39535047@qq.com。