血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6 水平早期检测在AMI 患者中的应用价值

崔雅璇 陈旭 刘倩 孙佳乐

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一种由冠状动脉急性血栓引起的心肌缺血性疾病，其发病机制复杂，与冠状动脉粥样硬化、血液高凝状态、炎性反应有关［1］。早期准确诊断及血运重建是修复心肌损伤及改善患者预后的重要环节。生长停滞特异性蛋白6（growth arrest⁃specific gene 6，Gas6）是分泌型维生素K 依赖蛋白，参与细胞增殖、分化、稳态维持及免疫炎性调节反应。李迪等［2］研究指出血清Gas6 水平与AMI发生呈正相关，可指导AMI 的早期诊断。微小RNA（micro RNA，miRNA）作为一种内源性的非编码RNA 广泛存在于真核细胞中，其可靶向结合mRNA，阻断蛋白基因表达。越来越多的证据显示miRNA 在多种心血管疾病中失调［3］。微小RNA⁃195（miR⁃195）属于miR⁃15/16/195/497 家族，人miR⁃195位于第17p染色体上，邻近抑癌基因p53，可调控细胞凋亡、侵袭及转移［4］。微小RNA⁃379（miR⁃379）是从人14q32.31 上MIR379 位点转录而来的一种miRNA，其被证明参与多种恶性肿瘤的进展［5］。目前临床关于血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6 水平对AMI 的早期诊断作用还需更多资料支持，本研究将通过分析血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6水平早期检测在AMI患者中的应用价值，以期为临床探索AMI的新的治疗靶点提供参考根据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2021 年5 至2022 年7 月于首都医科大学附属北京世纪坛医院心内科住院治疗的265 例患者，其中127 例AMI 患者（包括ST 段抬高及非ST段抬高的AMI）设为AMI 组；剩余138 例非AMI患者（包括心律失常、心肌炎、稳定性心绞痛、高血压）设为非AMI 组；选取同期120 名健康体检者，设为对照组。纳入标准：①AMI 组患者符合《急性冠脉综合征急诊快速诊疗指南》［6］中诊断标准，首发AMI，发病时间＜24 h；②对照组受试者无心脑血管疾病；③所有受试者自愿参加本研究，签署知情同意书者。排除标准：①接受溶栓治疗、冠状动脉经皮介入治疗者；②哺乳或妊娠期妇女；③合并精神异常、血液系统疾病、自身免疫性疾病、肝肾功能不全及恶性肿瘤者；④入院前1 个月服用抗炎药物或合并急慢性感染性疾病者。本研究符合赫尔辛基人体试验准则，经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 基线资料收集

采用横断面研究，收集AMI 组、非AMI 组入院后基线资料对照组基线资料，包括性别、年龄、身体质量指数（body mass index，BMI）、吸烟史、饮酒史、合并糖尿病例数、合并高血压例数及白细胞计数（white blood cell count，WBC）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low⁃density lipoprotein cholesterol，LDL⁃C）、高密度脂蛋白胆固醇（high⁃density lipoprotein cholester⁃ol，HDL⁃C）、左心室射血分数（left ventricular ejec⁃tion fraction，LVEF）水平。

1.2.2 血液样本的采集及相关指标水平测定

非AMI 组及AMI 组患者留取入组后空腹静脉血5 mL，对照组受试者留取体检当日清晨外周静脉血5 mL，置于EDTA⁃2Na 抗凝管，4℃下3 500 r/min 离心5 min，离心半径10 cm，分离血浆，于-80℃冰箱保存备用。

采用mini⁃VIDAS 全自动免疫荧光酶标仪以ELISA 法检测血浆Gas6 水平，相关试剂盒购自默克生物，检测过程严格按照试剂盒操作流程。

采用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantita⁃tive real⁃time polymerase chain reaction，qRT⁃PCR）测定血浆miR⁃379、miR⁃195的相对表达量：采用miRNeasy Mini kit 试剂盒提取血浆总RNA，以美国NanoDrop2000 超微量分光光度计检测RNA 浓度和纯度，采用反转录试剂盒（日本TaKaRa）合成cDNA，配制10 μL PCR 反应体系。采用美国BioRad qRT⁃PCR 仪行PCR 3 步法扩增，共45 个循环。上述qRT⁃PCR 反应酶及相关引物由翌圣生物科技（上海）股份有限公司提供。以U6为内参基因，采用2⁃ΔΔCt法计算miR⁃379、miR⁃195的mRNA 相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT⁃PCR 引物序列表Table 1 RT⁃PCR primer sequence

1.3 观察指标

①比较AMI 组、非AMI 组、对照组三组受试者入组时的血浆miR⁃379、miR⁃195的表达量及Gas6水平；②分析AMI 患者血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6 水平的相关性；③分析AMI 患者入组时的血浆Gas6、miR⁃379、miR⁃195水平对早期AMI 的诊断价值。miR⁃379、miR⁃195、Gas6 联合诊断AMI 标准：当三个指标同时诊断为AMI 阳性时则判定为AMI 阳性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据处理，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差检验，进一步组间比较采用q检验；计数资料比较以n（%）表示，采用χ2检验；采用Pearson 相关性系数分析AMI 组入组时血浆Gas6 水平与miR⁃379、miR⁃195表达量的关系；以敏感度为纵坐标，1⁃特异度为横坐标，绘制血浆Gas6 水平与miR⁃379、miR⁃195表达量对早期AMI 诊断价值的ROC 曲线，计算曲线下面积（area under curve，AUC）及最佳截断值（Cut⁃off值）；以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组基线特征比较

AMI 组、非AMI 组及对照组受试者年龄、性别、BMI、饮酒史、吸烟史、TC 水平、HDL⁃C 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；AMI 组及非AMI组合并糖尿病及高血压例数比较差异无统计学意义（P＞0.05）；三组WBC 计数、LDL⁃C 水平、LVEF值比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 三组基线资料比较［n（%），（）］Table 2 Comparison of baseline data among the three groups［n（%），（）］

表2 三组基线资料比较［n（%），（）］Table 2 Comparison of baseline data among the three groups［n（%），（）］

2.2 三组入组时血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6 水平比较

AMI 组、非AMI 组及对照组入组时的血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6 水平比较差异有统计学意义（P＜0.05）；miR⁃379水平比较：AMI 组＜非AMI 组＜对照组，miR⁃195、Gas6 水平比较：AMI 组＞非AMI 组＞对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 三组入组时血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6水平比较（）Table 3 Comparison of plasma miR⁃379，miR⁃195 and Gas6 levels at admission among the three groups（）

表3 三组入组时血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6水平比较（）Table 3 Comparison of plasma miR⁃379，miR⁃195 and Gas6 levels at admission among the three groups（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与非AMI 组比较，bP＜0.05。

2.3 AMI 组入组时血浆Gas6、miR⁃379、miR⁃195水平的关系

Pearson 相关系数分析显示，AMI 组患者入组时的血浆Gas6 水平与miR⁃379水平呈负相关（r=-0.317，P=0.019），与miR⁃195水平呈正相关（r=0.235，P=0.039）。

2.4 患者入组时血浆Gas6、miR⁃379、miR⁃195 水平对早期AMI 的诊断价值

以入组时的血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6 水平为检验变量，以AMI 患病情况为状态变量，取状态变量值为1，绘制ROC 曲线，结果显示血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6 水平单独诊断早期AMI 的效能（AUC=0.808、0.718、0.752）低于三者联合诊断（AUC=0.879）。见表4、图1。

图1 ROC 曲线图Figure 1 ROC curves

表4 入组时血浆Gas6、miR⁃379、miR⁃195 水平对早期AMI 的诊断价值Table 4 Diagnostic value of plasma Gas6，miR⁃379 and miR⁃195 levels at admission on early AMI

3 讨论

AMI 发病迅猛，进展快，若救治不及时可引发休克、心力衰竭及死亡。有研究显示，不同疾病严重程度AMI 患者的预后差异明显，早识别、早干预可有效提高治疗效果［7］。积极探寻可应用AMI 早期诊断的外周血标志物是临床医患共同关注的焦点。Gas6可参与细胞增殖、凋亡、氧化应激以及炎症反应过程，研究［8］表明，Gas6 与心血管疾病的发生和发展密切相关，其水平变化可能有助于判断患者病情。miRNA含有22 个核苷酸，可通过表达基因的抑制及mRNA 的降解发挥基因沉默作用。研究发现，miRNA不仅可调控心脏发育及心肌重构，还参与心脏疾病的诊断及预后评估［9］。本研究证明，血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6 可指导AMI 的早期诊断。

本研究采取横断面调查，将到心内科住院治疗的患者分为AMI 组及非AMI 组，另取健康体检者做对照，结果显示三组入组时miR⁃379水平比较：AMI 组＜非AMI 组＜对照组；miR⁃195、Gas6 水平比较：AMI 组＞非AMI 组＞对照组。提示血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6 水平与AMI 发生发展有关。Caldentey 等［10］以227 例ST 段抬高型心肌梗死（ST⁃segment elevation myocardial infarction，STEMI）患者为受试对象，发现其术后的血清可溶性AXL（soluble Axl，sAXL）及Gas6 水平明显升高，指出Gas6⁃AXL 系统介导STEMI 后左心室重构。崔秀兰等［11］研究则发现，AMI 患者及经皮冠状动脉介入治疗术后患者血浆Gas6 水平明显升高，Gas6 可能通过调节炎症反应参与AMI 经皮冠状动脉介入治疗术后的病理过程。有报道称，miR⁃379可作为治疗MI 的最新靶点，miR⁃379可通过与肿瘤坏死因子⁃α⁃诱导蛋白8（tumor necrosis factor⁃α induced protein 8，TNFAIP8）结合抑制细胞核因子（nuclear factor kappa⁃B，NF⁃κB）信号通路，降低心肌细胞凋亡，以保护心功能［12］。还有学者证明，miR⁃195可通过上调转化生长因子⁃β1（transforming growth factor beta 1，TGF⁃β1）/Smad 信号通路促进MI 大鼠心肌纤维化［13］，这为本研究提供理论支持。本研究通过进一步分析发现，AMI 组患者血浆Gas6与miR⁃379呈负相关，与miR⁃195水平呈正相关，进一步表明miR⁃379、miR⁃195参与了AMI 发病过程。ROC 曲线分析显示，血浆miR⁃379、miR⁃195、Gas6 水平单独诊断早期AMI 具有一定局限性（AUC=0.808、0.718、0.752），三者联合诊断的效能最佳（AUC=0.879），表明miR⁃379、miR⁃195、Gas6三者联合在AMI 的早期诊断中具有一定的应用价值。刘铁红等［14］指出，Gas6 升高是AMI 发生的独立危险因素，其诊断AMI 的AUC 为0.878。张淑华等［15］发现，随着AMI 患者胸痛时间的延长，其血浆miR⁃195 水平呈升高趋势，miR⁃195诊断AMI 的AUC 为0.940。还有研究表明，miR⁃379与AMI 患者CK⁃MB、CTn⁃I 呈负相关，ROC 诊断早期AMI 的AUC 为0.751［16］。上述研究中AUC 值与本研究结论存在一定出入，可能受样本量波动影响。

综上所述，与健康对照组及稳定性非AMI 组受试者相较，AMI 组患者的血浆miR⁃195、Gas6 水平异常升高，miR⁃379水平异常降低，三指标可指导AMI 的早期诊断。