JMJD2B、HPIP对宫颈癌Hela细胞生物学行为的影响

李媛, 苗晓红

1.遵化市人民医院妇科,河北唐山064200;2.唐山市妇幼保健院妇科,河北唐山063000

宫颈癌是妇科常见肿瘤,目前临床常采用手术、放疗、化疗等治疗,但患者生存率仍然较低[1],寻找宫颈癌早期分子标志物及潜在治疗靶点已成为研究热点。JMJD2B是缺氧诱导因子-1α的下游靶基因,在肿瘤发生发展中发挥重要作用[2-3],下调JMJD2B表达水平可抑制卵巢癌细胞增殖[4]。HPIP是转录因子PBX的辅助抑制剂,参与器官形成和肿瘤发生[5],HPIP在宫颈鳞癌中表达上调[6],影响宫颈鳞癌发展进程。而JMJD2B和HPIP与宫颈癌的关系目前少见报道,本文主要分析JMJD2B、HPIP对宫颈癌Hela细胞生物学行为的影响,以期为宫颈癌基础和临床研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要仪器、试剂和细胞

CCK-8试剂盒购于武汉纯度生物科技有限公司;TRIzol试剂购于上海文韧生物科技有限公司,反转录试剂盒、定量PCR试剂、酶标仪购于上海研卉生物科技有限公司;荧光定量PCR仪购于上海佐明机械设备贸易有限公司;JMJD2B抗体、HPIP抗体购于上海雅吉生物科技有限公司;辣根过氧化物酶标记的抗兔、抗鼠二抗购于上海科敏生物科技有限公司。携带JMJD2B基因片段si-JMJD2B、携带HPIP基因片段si-HPIP和无同源性阴性对照载体[si-NC-JMJD2B(si-NC-J)和si-NC-HPIP(si-NC-H)]购于美国Invitrogen公司;si-JMJD2B序列为5′-UCUCCAUCACCUGCCUCAAGCACAA-3′,其si-NC序列为5′-CCUACAUCCCGAUCGAUGAUGUUGA-3′;si-HPIP序列为5′-CTGCTGGACAAGCTGGCCAAGGAGAACCA-3′,其si-NC序列为5′-CGGCAAGCUGACCCUGAAGTT-3′。

宫颈癌细胞系Hela和人正常宫颈上皮细胞(normal human cervical epithelial cells,HUCEC)购于中科院上海细胞库。

1.2 细胞培养及转染

将Hela细胞和HUCEC置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养,并选用对数生长期细胞进行后续实验。实验将细胞分si-JMJD2B组、si-NC组、si-HPIP组,根据转染试剂说明书,分别将si-JMJD2B、si-NC、si-HPIP质粒转染至si-JMJD2B组、si-NC组、si-HPIP组细胞,培养48 h后收集细胞,以备后续实验。

1.3 qRT-PCR检测JMJD2B和HPIP mRNA表达

采用TRIzol法提取细胞中总RNA,反转录获得cDNA,进行qRT-PCR扩增,设置反应条件以β-actin作为反应内参。采用2-ΔΔCT法计算目标基因mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.4 Western blotting检测JMJD2B和HPIP蛋白水平

收集Hela、HUCEC、si-NC-J、si-JMJD2B、si-NC-H、si-HPIP组细胞加入裂解液提取总蛋白进行电泳后转膜,封闭1 h,加入JMJD2B、HPIP一抗(1∶2 000),4 ℃过夜孵育。添加相应二抗(1∶3 000)室温孵育2 h,洗涤。ECL化学发光液显色,以β-actin为内参,成像系统获得蛋白质条带。

1.5 Hela细胞增殖实验

收集si-NC-J、si-JMJD2B、si-NC-H、si-HPIP组细胞(5×103个/孔)接种于96孔板中,将细胞置于CO2培养箱进行培养,每孔加入10 μL CCK-8溶液,避光孵育2 h,于0、24、48、72、96、120 h时使用酶标仪(λ=450 nm)检测细胞光密度(optical density,OD),本实验平行重复3次。

1.6 Hela细胞Transwell侵袭实验

在24孔板中,将5×104个/mL细胞悬液接种于内铺Matrigel胶的Transwell小室中,于37 ℃、5%CO2培养48 h。用棉签擦去Transwell小室面上的细胞,固定结晶紫染色,随机取5个视野于显微镜下拍照,计数。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 Hela细胞和HUCEC中JMJD2B、HPIP蛋白表达的比较

Western blotting结果显示,宫颈癌Hela细胞JMJD2B、HPIP蛋白表达高于HUCEC(P<0.05;图1)。

图1 Hela细胞和HUCEC中JMJD2B、HPIP蛋白表达的比较a为P<0.05,与HUCEC比较。

2.2 si-JMJD2B或si-HPIP对Hela细胞JMJD2B、HPIP mRNA和蛋白表达的影响

qRT-PCR和Western blotting结果显示,Hela细胞转染si-JMJD2B、si-HPIP后,JMJD2B和HPIP的mRNA和蛋白表达均降低(P<0.05;图2)。

图2 si-JMJD2B、si-HPIP对Hela细胞JMJD2B、HPIP mRNA和蛋白表达的影响a为P<0.05,与si-NC-J组比较;b为P<0.05,与si-NC-H组比较。

2.3 si-JMJD2B、si-HPIP对Hela细胞增殖的影响

细胞增殖实验结果显示,si-JMJD2B组和si-HPIP组细胞增殖活力明显小于si-NC-J组或si-NC-H组(P<0.05;图3)。

图3 si-JMJD2B和si-HPIP对Hela细胞增殖活力的影响a为P<0.05,与同时间si-NC-J组比较;b为P<0.05,与同时间si-NC-H组比较。

2.4 si-JMJD2B和si-HPIP对Hela细胞迁移和侵袭的影响

Transwell实验结果显示,si-JMJD2B组和si-HPIP组迁移、侵袭细胞数量明显低于si-NC-J组或si-NC-H组(P<0.05;图4)。

3 讨 论

宫颈癌是严重威胁全球女性生命健康的恶性疾病,近年来,宫颈癌发病率呈上升趋势,且患者年龄越来越小[7]。传统宫颈癌治疗以手术和放化疗为主,但其治疗效果及患者预后并不能达到理想状态[8]。因此,寻找宫颈癌预防、诊断及治疗的生物标志物,对治疗和控制患者疾病发展具有至关重要的意义。

本研究Western blotting检测结果显示,JMJD2B、HPIP在宫颈癌Hela细胞中蛋白表达高于HUCEC,推测JMJD2B和HPIP表达水平与宫颈癌发展进程存在一定关联。JMJD2B是组蛋白去甲基化酶JMJD2家族成员,能够识别二甲基化和三甲基化H3K9、H3K36,引起组蛋白的去甲基化[9]。组蛋白修饰是表观遗传学机制之一,而组蛋白甲基化是组蛋白修饰的一种方式,组蛋白修饰与基因的失活、X染色体失活、基因印记等基因沉默现象以及DNA修复有关[10-11]。有研究显示,HPIP蛋白高表达与子宫内膜癌发展进程有关[12]。这些研究均表明JMJD2B和HPIP异常表达与肿瘤的发生发展有关,本研究结果显示,JMJD2B和HPIP在宫颈癌细胞中高表达,其异常表达可能与肿瘤恶性行为学有关,与上述其他研究结果类似。

本文分别构建干扰JMJD2B和HPIP基因表达模型,进行一系列功能实验。本研究结果显示,与si-NC-J组相比,si-JMJD2B组JMJD2B mRNA和蛋白表达水平降低;与si-NC-H组相比,si-HPIP组HPIP mRNA和蛋白表达水平降低,提示JMJD2B和HPIP细胞干扰模型构建成功。本研究发现,宫颈癌细胞干扰JMJD2B和HPIP基因表达后,细胞光密度、迁移和侵袭数量明显下降。JMJD2B在干细胞分化、炎症和多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要的表观遗传学作用[13],既往研究显示,下调JMJD2B表达可以抑制卵巢癌细胞增殖能力[2]。HPIP蛋白具有多种功能,是肿瘤发生过程中重要的分子生物标志物[14]。研究显示,HPIP蛋白异常表达与乳腺癌、肺癌和胃癌等多种肿瘤发生和转移有关[15]。既往研究显示,转化生长因子-β1可以通过HPIP诱导非小细胞肺癌A549细胞增殖和转移[16]。结合本研究结果表明,干扰JMJD2B和HPIP表达,Hela细胞增殖、迁移和侵袭能力受到抑制,进而抑制宫颈癌细胞的恶性行为学,JMJD2B和HPIP差异表达均能影响宫颈癌细胞生理病理过程。

综上所述,JMJD2B和HPIP基因在宫颈癌细胞中表达上调,干扰JMJD2B和HPIP基因表达可明显削弱Hela细胞增殖、迁移和侵袭能力,影响宫颈癌发展进程。对于MJD2B和HPIP基因之间是否存在关联尚需进一步分析,且本项研究缺乏临床数据支持,今后需深入探究。