超声对发酵食品微生物和品质的影响

檀茜倩，崔方超，吕欣然，李学鹏，励建荣*

（1 渤海大学食品科学与工程学院 辽宁锦州121013 2 天津科技大学食品科学与工程学院 天津 300457）

发酵是一种传统的食品保藏方法，是乳酸菌、芽孢杆菌、醋酸菌和酵母等益生微生物以食物为底物进行代谢的过程。由于富含益生菌群以及功能活性物质，发酵食品具有预防慢性疾病[1]、调节肠道菌群和提高免疫能力[2]等作用，部分研究表明食用发酵食品还可以降低Covid19 的感染率[3]及防止感染Covid19 后发展为危重症[4]，因此发酵食品具有作为功能食品的潜力。

发酵食品的品质和功效与发酵原料、发酵工艺和微生物活动有关。其中发酵原料有受到化学（杀虫剂、重金属等）或食源性致病微生物污染的风险，致病微生物自身的致病侵袭力、其代谢活动所产生的毒素、亚硝酸、生物胺等有可能损害人类健康（致病、中毒或严重过敏反应等）[5]。同时，在发酵开始前需要对发酵原料进行一定预处理来控制原料内源酶活性。在发酵过程中也需要合理控制益生微生物活性，来掌握发酵速率和时间，因为发酵速率过慢会造成腐败菌生长繁殖，进而导致发酵食品腐败[6]，而过度发酵则会影响发酵食品品质和口感（酸奶的过度酸化、泡菜过度发酵变软等）。针对上述问题在传统和工业发酵中常用热处理方法，然而热处理造成的发酵食品组分分子结构破坏和改变，还会在一定程度上影响发酵食品的口感、风味和营养价值。超声技术是一种非热处理技术，已经在食品工业中应用于包括杀菌、促进活性产物提取、辅助酶解、改变食物分子结构等很多方面[7-8]。近年来，研究人员关注到超声技术处理能通过抑制或调控发酵食品微生物的活动来改善控制发酵食品的发酵过程和品质（图1）。本文对超声技术在一些常见发酵食品的加工和贮藏中的应用进行总结，讨论了超声技术如何影响发酵过程、发酵食品菌群，以及常见发酵食品营养成分和功能，并分析超声处理改善发酵工艺、保证发酵食品安全性和改善发酵食品品质的方法，以及在超声技术应用过程中所需要考虑的非技术因素。以期为利用超声技术在发酵食品生产中的应用提供参考。

图1 超声技术对常见发酵食品微生物和品质的影响Fig.1 The effects of ultrasonic technology on the microbiology and quality of commonly fermented foods

1 超声技术对发酵食品中微生物的影响

超声根据频率高低可分为高功率低频（20～100 kHz）、中功率中频（100 kHz～1 MHz）和低功率高频（1～100 MHz），食品生产中采用的超声频率为20～100 kHz。超声形成的孔洞效应可以使食品发生一些物理和化学方面的改变，因此常应用于活性产物提取、液体乳化、排气以及切割等单元操作[9]。超声根据强度又可以分为高强度超声（强度大于3 W/cm2）和低强度超声（强度小于3 W/cm2）。高强度超声对细胞破坏性较高，常被用作食品改性以及食品中微生物的灭活/失活；低强度超声对细胞的破坏性较低，常用于加速微生物内部生物化学反应速率，来提高生物转化过程[10-11]。总而言之，超声既可以通过化学效应破坏活细胞结构杀死细胞，也可以刺激细胞活动来改变细胞膜穿透性，提高活性产物提取效率，增加酶活，防止酶变性等[12]，处理效果与超声处理参数（频率、强度、处理时间、次数等）、微生物菌株类型以及食品基质有关[13]。

1.1 对微生物生长的抑制

高频率和高强度超声处理可抑制或杀灭微生物，可能是多种机制联合作用的结果，图2 为一些常见超声抑制微生物机制示意图，主要包括超声形成气泡破碎产生压力对细胞造成损伤，在细胞膜上形成孔洞，改变细胞膜穿透性，产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）对细胞造成攻击损伤，化学效应对细胞造成损伤，产生抗菌物质抑菌，使参与细胞代谢的跨膜蛋白以及参与关键生化反应的酶失活，直接抑制代谢过程以及破坏遗传物质DNA 等[14]。高强度超声处理对微生物造成的损伤和破坏一般不可逆。在这个过程中，一部分细胞与超声直接接触，在超声处理产生气泡随机破裂形成的压力和剪切力作用下发生细胞结构损伤；另一部分细胞虽然没有与超声直接接触，但仍会受到超声处理在细胞外产生的H2O2等抑菌物质以及细胞内产生的ROS 等自由基的影响，导致包括DNA 和各种酶在内的参与细胞代谢和关键生化反应的组分受到破坏，进而造成细胞死亡[15]。

图2 超声对微生物抑制机制示意图Fig.2 Schematic diagram of microbial inactivation mechanism of ultrasound

超声杀菌的抑菌谱较宽，对细菌、真菌和病毒均有抑制作用[16-18]，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、甲型肝炎病毒和鼠诺如病毒等。超声对微生物的杀灭作用与微生物的种类和形态有关，含有较厚细胞壁的革兰氏阳性菌和酵母相对于革兰氏阴性菌对超声有更强的耐受性[16]。微生物的形态也影响了其对超声的耐受性，球菌比杆菌对超声的耐受性更高，这与球菌相比杆菌与超声接触的比表面积更大有关。对于特定微生物来说，超声处理条件越强，对微生物的杀灭作用越强，因为高强度超声产生的机械损伤形成的自由基浓度，对细胞增殖和代谢活动必须的DNA、脂肪和蛋白质等的破坏都更大[17]。部分细菌中存在耐受超声压力基因（如大肠杆菌中的dnaK 基因）[19]，使得这部分细菌相对于其它细菌来说对超声耐受性更强。为了提高超声的抑菌效果，目前也多采用加入声敏剂（亚甲基蓝）或与其它抗菌剂或抗菌方法联合使用，不仅可以提高单位时间抑菌数目，缩短抑菌时间，也对生物被膜态细菌有比较好的清除作用[20]。表1 列举了部分超声单独或者与其它方法联合对微生物的抑制条件和抑制效果。

表1 超声处理对微生物的抑制作用Table 1 Microbial inactivation effect of ultrasound

表2 超声处理对微生物生长的调控作用Table 2 Microbial regulation effect of ultrasound

1.2 对微生物生长的调控

超声处理除了可以起到杀灭微生物的作用，研究发现特定条件超声处理可调控微生物的生长和代谢，尤其是对发酵中起主要作用菌株的调控，会在很大程度上影响发酵过程和发酵食品品质。这些调控作用主要包括刺激或减弱菌株生长，改变代谢物分泌谱，诱导细胞进行生物合成和富集营养素等。虽然目前超声抑制微生物的机制已经比较明确，但超声调控微生物的机制还有待完善。现有研究认为超声对微生物的调控机制（图3）主要包括增加细胞膜通透性，加速细胞内部与外界环境之间营养物质交换，促进细胞排出有毒代谢废弃物，改变酶构象提高细胞内部生化反应效率，以及由细胞外部环境代谢物变化引发联锁效应，改变细胞内级联化学反应等[31-33]。超声处理对微生物生长的调控受到包括超声参数（超声功率、强度和频率）的影响，也与菌株特点和所处环境有关[34]。

图3 超声对微生物生长调控机制示意图Fig.3 Schematic diagram of the microbial regulation mechanism of ultrasound

1.2.1 提高微生物的生长速率 超声处理可以通过改变微生物细胞膜结构（磷脂双分子层的酰基链、极性头部和周质空间）来提高菌株的生长速率。研究发现频率20 kHz 的超声处理会促进干酪乳杆菌（Lactobacillus sakei）的生长，扫描电镜显示超声处理可在干酪乳杆菌细胞表面形成孔洞，然而此作用条件下形成的孔洞是暂时的，在一定条件下可被修复。可逆孔洞的存在增大了氧气和营养素向细胞内的传递量，以及细胞内废弃物向胞外的转运量，因此提高了细胞的生长速率[35]。同时，超声处理也显著改变了干酪乳杆菌的代谢通路，其效果与不同超声频率有关。在碳源利用方面，超声处理频率为130 kHz 和950 kHz 相比于20 kHz，干酪乳杆菌对D-甘露糖、半乳糖醇、蔗糖、D-纤维二糖和肌苷等碳源的利用率显著提高；在羧酸生成方面，超声处理频率在20 kHz 相比于45 kHz，丁酸、衣康酸、山梨酸和酒石酸的产量较高；在醇生成方面，上述4 种超声频率都可以促进2-氨基乙醇和2，3-丁二醇的产生[32]。另一项研究也证实超声可影响植物乳杆菌AF1（Lactobacillus plantarum AF1）的碳代谢过程，其葡萄糖、半乳糖和乳酸等碳代谢产物随着发酵时间和超声处理时间的延长而显著增加[33]。超声对微生物生长促进已经应用到发酵食品的生产中，可利用超声处理改造作为发酵剂的菌株；或通过在发酵不同阶段施加超声处理，通过干预微生物生长和增殖有效调节发酵过程[9]。

1.2.2 增加微生物酶的分泌和酶活力 超声处理可以促进微生物酶的分泌并且可在一定程度上提高酶活力。以β-葡萄糖苷酶为例，β-葡萄糖苷酶是在植物食品发酵中起重要作用的一类酶，可将葡萄糖苷异黄酮水解为糖苷配基。研究发现频率为20 kHz 的超声处理可以使嗜酸乳酸菌BCRC 1069（Lactobacillus acidophilus BCRC 1069）产β-葡萄糖苷酶的能力提高2 倍，其原因是由于超声产生的孔洞效应增加了嗜酸乳酸菌BCRC 1069细胞膜通透性，促进了细胞代谢所产生的β-葡萄糖苷酶从胞内向胞外的转运，因此，胞外β-葡萄糖苷酶的总量提高[36]。另一项研究发现频率为24 kHz 的超声处理能提高乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.Lactis）分泌的β-葡萄糖苷酶活性，其原因除了由于细胞膜通透性改变促进酶由胞内到胞外传递，还与超声改变了酶的蛋白构象有关，超声对酶构象的改变暴露出更多的活性位点，使酶与底物的反应几率增加，酶活力变大。超声还能提高糖酵解途径中主要调节酶的活性[37]，进而影响细胞内级联化学反应改变微生物代谢图谱，研究发现超声处理可提升β-半乳糖苷酶活性，促进乳糖向葡萄糖和半乳糖的转化，使乳酸产量提高[31]。

1.2.3 促进生物合成过程和营养素富集 在亚致死超声处理条件下，超声能诱导加速细胞内生物合成过程的进行以及促进营养素富集，有利于提高生物活性物质产量，以及增强益生微生物的功能特性。有研究表明超声处理通过干预植物乳杆菌（L.plantarum）主要生长因子，进而加速细胞内部生物化学反应，促进植物乳杆菌分泌表面活性素[38]。利用频率为28 kHz 的超声处理可增加酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞内部Ca2+的离子浓度，促进乙醇产量提升[37]。低密度超声（16～100 kHz）能在不同程度上加速短乳杆菌（Lactobacillus brevis）增殖，提高γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）的产量[39]，GABA 是一种非蛋白类氨基酸，在神经传导方面有很多功用，而少量GABA 不能达到益生效果，GABA 的富集对益生菌发挥益生作用具有非常重要的意义。

2 超声技术对发酵食品品质的影响

2.1 发酵乳

在发酵乳的生产中，超声常作为一种均质方法[43]，获得的脂肪颗粒更为细腻，同时超声可通过影响乳酸菌代谢活动改变代谢谱图以及提高发酵效率，可以在一定程度上改善发酵过程。已证实超声能够提高水牛乳中唾液链球菌嗜热亚种（Streptococcus thermophilus subsp.Salivarius）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）的代谢活性，缩短发酵时间[44]。利用超声辅助发酵kefir 酸奶，在超声频率24 kHz，超声功率400 W，超声时间5 min，探头直径22 mm，30%振幅条件下连续处理，不仅可以缩短1 h 发酵时间，同时也可提高乳酸的产率和乳酸菌胞外多糖的产量，赋予kefir 酸奶更好的口感[45]。超声还能够增加发酵乳的营养功能，研究发现超声可提高植物乳杆菌AF1 发酵的酸奶的抗氧化活性，增加了其作为功能性食品的功效[33]。

2.2 发酵果汁

超声处理已经应用在发酵苹果汁[46]、桑葚汁[47]等发酵果汁的生产中，可以显著改变发酵果汁的理化特性尤其是影响可挥发性物质的种类和产量，使发酵果汁口感丰富，感官评价更高。低密度超声处理可提高作为发酵剂益生菌株的发酵性能，应用于果汁发酵后，通过影响代谢物变化，改变发酵果汁的风味和功效，其中涉及多个代谢通路。首先超声处理会干预糖酵解途径和三羧酸循环，进而影响氨基酸代谢，甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸等氨基酸通过脱羧作用以及随后的一系列化学反应对果汁特殊风味的形成具有重要意义。超声对发酵果汁中氨基酸代谢的影响与超声强度有关，相对于较高的超声强度（93.6 W/L），较低强度（58.3 W/L）对氨基酸影响相对较小，然而其原因还有待于进一步探究。超声处理还能促进益生菌对多酚的转化（主要发生在益生菌生长的延滞期和对数期），以及能够增加果汁抗氧化能力，从而提高了发酵果汁的营养功效[46]。

超声处理也可以用来降低发酵果汁饮料酸化程度，可在不影响益生菌活性和功能的前提下控制作为发酵剂菌株的数量和活动，从而减少由于菌株过度代谢活动对发酵饮料风味和流变特性产生的不利影响。研究发现超声处理可减弱乳杆菌（Lactobacilli）和双歧杆菌（Bifidobacteria）的代谢活性，然而并不影响植物乳杆菌L12 对Caco-2 细胞的黏附特性[48]，因为与肠上皮细胞的黏附被认为是益生菌发挥益生作用的一个重要条件，这说明超声处理有可能不会影响到菌株的益生特性，而这方面的论证仍需更多深入研究数据支持。

2.3 酒

葡萄酒酿造过程中有可能受到腐败菌污染，同时葡萄酒中有比较复杂的乳酸菌和酵母菌群，如果在发酵过程结束后微生物种群没能得到很好控制，会因为继续发酵而影响酒的品质[49]。一直以来，常通过二氧化硫来控制葡萄酒中非酵母菌群和腐败菌生长，同时也能减少葡萄酒中氧的含量，然而二氧化硫的过量添加会因为硫醇或者硫化氢的生成导致葡萄酒产生不良风味，二氧化硫也可能会引发特定人群的过敏反应[50]。超声处理由于对微生物的抑制和调控的双重作用，可以代替二氧化硫对葡萄酒中的菌群进行控制进而保持葡萄酒的稳定性[51]。超声处理一方面可以增加葡萄酒中有益物质的含量，例如能够改变葡萄酒中多酚以及芳香物质的组成[52]。多酚类物质是葡萄酒中含量最多和最重要的物质，具有抗氧化活性，可缓解心脏疾病和其它慢性疾病，红葡萄酒比白葡萄酒多酚含量更高，多酚的存在对葡萄酒的颜色和风味有很大影响。另一方面超声处理能够减少葡萄酒酿造过程中有害物质产生，例如减少生物胺的含量。生物胺由氨基酸经过脱羧反应生成，葡萄酒中生物胺含量多少取决于氨基酸前体的数量，也与pH、醇、二氧化硫含量等微生物生长代谢因子有关。葡萄酒中常见的生物胺有组胺、尸胺、酪氨、苯（基）乙胺、腐胺、色胺，葡萄种类、地理区域、酿造方法以及老化过程也有一定影响[53]，所以在利用超声降低葡萄酒中生物胺的过程中需要综合考虑这些因素。除了降低生物胺含量，超声处理还能降低葡萄酒中酒精含量，从而提升葡萄酒的感官品质，其原因与超声的孔洞效应、自由基胁迫和随之引发的连锁效应有关[54]。

2.4 醋

超声处理可以提升醋的品质[55]，加速其陈化过程[56]，这与发酵剂组成（单菌/混菌）[57]有关，也受到发酵容器材质的影响。超声处理对醋陈化的促进作用明显，研究发现采用超声处理新酿造的浙醋，能使其品质达到2～3 年酿造醋的效果[58]。同时超声处理还可以增加醋中活性产物含量，提高醋的功能特性。有研究发现超声处理能改变月桂樱醋的光学微观结构，提高其挥发性物质的含量，增强其抗糖尿病以及抗高血压的能力[59]。

2.5 发酵蔬菜

发酵蔬菜包括干腌和卤水浸泡两种方式，卤水浸泡比较常见。在卤水浸泡的过程中，益生菌活动分解植物产生氨基酸等代谢物质赋予了发酵蔬菜特殊的风味。盐是发酵蔬菜制作过程中的一种主要添加物，它的迁移遵循浓度梯度扩散的流体动力学机制，随着外部压力变化，可通过食物原料表面形成的孔洞进入内部。然而由于一些发酵蔬菜原料质地坚硬或者外皮饱满缺乏孔洞，减缓了盐的扩散过程，导致发酵时间过长，可能需数月才能获得预期风味，而在这个过程中由于微生物过度生长或者发酵蔬菜原料内部水分活度变化导致盐浓度降低，造成卤水变质等因素会对发酵蔬菜品质产生不利影响[6]，超声可以加速盐的转运和溶解，加速这个发酵关键步骤的进行，已经在辣白菜的腌制过程中得到证实，同时超声处理还能保持白菜的硬度和质构，保证食用口感[60]。

2.6 发酵香肠

超声影响发酵香肠品质是通过对微生物代谢，以及蛋白和脂肪水解的调控综合实现的。研究发现25 kHz、128 W 的超声处理干制发酵香肠可提升发酵香肠中微生物的发酵性能，改善发酵香肠的适口性和风味，超声处理改变了发酵香肠中游离氨基酸组成，增加了挥发性风味物质前体的含量，随后风味前体物质通过特定化学反应产生令人愉悦的风味[61]。频率为25 kHz 的超声处理salami 香肠9 min 对香肠中乳酸菌和微球菌的抑制效果最好，同时超声处理改变了salami 香肠的理化特性，能引起脂肪和蛋白氧化，其中亚铁血红素含量在超声处理后发生变性，含量略有下降，而肌红蛋白受超声影响不明显[62]。

2.7 酱

超声处理可增加酱类食品中的生物活性物质含量并提升其品质[63]。超声处理作为发酵剂的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）可以提高黄豆酱的发酵速率以及发酵后多肽的含量。研究发现超声没有增加菌株蛋白酶分泌量，而是促进菌株内生孢子萌发，使菌株在黄豆酱发酵中的延滞期缩短，加速了发酵过程从而促进水解[64]。低密度超声处理可以改变发酵低盐moromi 豆酱的风味，超声频率68 kHz（60 W/L/10 min/8 循环）可在较短时间显著提高低盐豆酱氨基酸的释放，加速豆酱熟化过程。超声能够促进发酵剂米曲霉（Aspergillus oryzae）碱性蛋白酶分泌，暴露更多的蛋白酶活性位点；也缩小了底物粒子，进而提高底物与酶的结合几率，使酶促反应效率提高；同时超声处理改变了有机呈味物质的组成，组氨酸和谷氨酸的增加尤为明显，使酱的口感更柔和、风味更令人愉悦[65]。在利用超声改良酱类发酵食品的过程中，一定要注意选择合适的超声参数，尤其注意长时间超声处理会对酶活产生不利影响[60]。

2.8 发酵谷物

超声可以应用于发酵面制品生产，研究发现超声辅助面团发酵可以显著改善馒头的硬度和体积，使其口感更好[66]。利用超声辅助副干酪乳杆菌LUHS244（Lactobacillus paracasei LUHS244）混合发酵生产白面包，使面包品质、适口性以及功能上都有很大提升[67]。

2.9 其它

超声还可用来辅助提取食品加工副产品发酵物中的功能物质，实现资源利用最大化和环境可持续发展。有研究证实超声可以应用于辅助提取黄豆粉中的酶[68]，以及辅助提取芽孢液态发酵豆渣中的特殊功能多肽。研究发现超声处理的频率、时间、功率和强度会在不同程度上影响功能多肽和其它可溶性蛋白的产率、结构和功能。超声强度0.08 W/mL、频率33 kHz 和处理时间1 h 与没有经过超声处理的发酵豆渣样品相比，由于特定超声频率的处理增大了胞内、胞外物质转化以及酶和底物的交换效率，其中多肽和可溶性蛋白含量分别提高了31.27%和18.79%；而当超声时间延长，超声的穿孔能力增加，相应的剪切力和涡流效应增加，较长时间超声处理形成不可逆孔洞效应和热效应导致微生物衰老以及死亡则会降低发酵产物产量，因此超声处理1 h 比2 h 的多肽提取量高；傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析发现超声处理后蛋白分子的结构发生改变，有去折叠现象，其中α 螺旋和β转角数目减少，而β 片层和无规卷曲比例有所增加，原子力显微镜（Atomic force microscope，AFM）观察到蛋白表面粗糙度增加；另外超声还提升了多肽提取物的体外抗氧化性（羟自由基和DPPH自由基的清除能力）以及乳化稳定性[69]。这些改变都有助于功能性活性肽的开发。

总之超声技术对发酵食品微生物和品质的影响受到操作参数（频率、强度、作用时间、次数）、菌株类型以及发酵食品基质的影响，在不同条件下，超声处理具有提高发酵速率，缩短发酵时间，控制发酵过程，减少过度发酵影响某些发酵食品品质，杀死腐败或致病微生物，保证发酵食品的微生物安全性，保持益生菌的活性和益生功效，以及增加发酵食品中的生物活性物质并提高其营养和保健价值等功用。

3 影响超声技术在发酵食品应用的非技术因素

为了超声技术处理的发酵食品能够大规模工业应用并成功走向市场，除了必要的技术支持，还需考虑消费者的心理因素（例如对超声技术处理发酵食品的接受度等）。目前，一些消费者认为研究人员或者企业对超声技术在内的一些新技术在食品工业应用的优势有所夸大，并不希望传统工艺被新工艺取代，更倾向于选择传统方式生产的发酵食品；也有消费者认为食用新技术处理的食品后会对健康产生负面影响。另外价格也是影响消费者接受度的一个非常重要的因素，需要生产商在加工成本和销售价格之间寻找平衡[70]，同时在销售策略的选择上也有必要综合考虑地区经济因素，例如经济比较发达地区的消费者可能更多的考虑安全性、口感，在经济发达程度较低地区的消费者则会更倾向于考虑价格[71]，需要根据消费市场调研做出正确的产品定位和销售策略。

4 展望

为了使超声技术在发酵食品的工业应用中获得预期效果，要充分考虑超声处理的操作参数，发酵食品中的菌群特点，食物分子组分以及消费者的心理预期。在今后的研究中有以下几个问题值得思考。

1）发酵食品种类繁多，由于不同发酵食品采用的原料和发酵剂不同，在选择超声技术时要充分考虑不同发酵食品自身的特点。

2）发酵底物对微生物的生长十分重要，目前超声对益生菌生长影响的研究底物主要为改良的培养基或模拟食物底物，对真实发酵过程中底物对益生菌的影响机制还不是十分清楚，需侧重探索在超声处理条件下食物组分对益生菌生长和代谢的影响以及食物与微生物、微生物菌群之间的互作机制。

3）目前已经发现适当强度的超声并不会完全杀死乳酸菌等益生菌株，处于这种状态的菌株仍可以恢复很好的生长活性，而这种状态下细菌的益生特性是否有新的变化，有待更深入和全面的研究数据的支持。

4）为探索超声调控发酵从而改善发酵食品品质的潜在机制，可同时利用多种技术建立相关的表型、菌株代谢和发酵食品之间的关系网络，从分子水平上系统性的解释相关问题。