自然杀伤细胞2组成员A、程序性死亡因子配体1表达检测对PD-L1阻断免疫治疗肌层浸润性膀胱癌反应性的预测价值

赵刚刚,张鸿毅,肖克兵,杨 辉,李子峰,赵华才

(西安医学院第一附属医院泌尿外科,陕西 西安 710077)

膀胱癌是一种发病率和病死率极高的恶性肿瘤,其在全球范围内对人类的生命健康均有较大威胁[1]。肿瘤浸润是造成患者病死的最主要原因,而患者出现肿瘤浸润主要是免疫逃逸造成的[2-3]。近年来,关于膀胱癌的治疗已取得较大进展,程序性死亡因子配体1(Programmed death factor ligand 1,PD-L1)阻断免疫治疗在膀胱癌中的应用取得了较为理想的效果,其能够通过抑制肿瘤细胞结合PD-1,减少肿瘤细胞的免疫逃逸,进而促进细胞毒性T淋巴细胞的死亡[4-5]。自然杀伤细胞2组成员A(Natural killer cell group 2 member A,NKG2A)是抑制NK细胞的抑制性受体,其对于自然杀伤细胞杀伤靶细胞具有抑制作用[6]。PD-L1是一种存在于多种癌症中的T细胞调节因子,有研究显示肿瘤内CD8+T细胞浸润数量越多,其表达水平越低,提示其表达与肿瘤浸润存在负相关[7]。但是目前关于NKG2A和PD-L1表达是否能预测膀胱癌治疗反应性的研究不足,因此本研究对接受PD-L1阻断免疫治疗的肌层浸润性膀胱癌患者NKG2A和PD-L1表达对其治疗反应性的预测价值进行观察,现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性选取2019年1月至2022年11月收治的100例肌层浸润性膀胱癌患者为研究对象,病例纳入标准:经病理检查诊断为膀胱尿路上皮癌;分期为pT2N0M0[8];于我院接受PD-L1阻断免疫治疗;未合并其他恶性肿瘤。排除标准:病理检查确诊为非肌层浸润性膀胱癌;发生远处转移;合并自身免疫性疾病;严重器官功能异常;临床资料不完整。本研究经医院医学伦理委员会同意。

1.2 研究方法 ①治疗前NKG2A和PD-L1表达水平检测:采集患者空腹静脉血5 ml置于样本管中,对其采用荧光标记法进行染色。取5 ml在样本管内加入100 μl EDTA 抗凝全血,将单克隆抗体CD3(PE-Cy7标记)、CD4(Per CP标记)、CD8(FITC标记)、NKG2A(PE标记)以及PD-L1(PE标记)分别加入样本管内,在室温避光25 min 后加入3 ml溶血素,继续于室温避光孵育12 min,保证样本管内溶血充分。以3000 r/min的速度进行离心10 min,弃去上清液,采用磷酸缓冲液进行洗涤2次,最后加入200 μl含有1% 多聚甲醛的磷酸缓冲液进行悬浮。采用Wmini5146流式细胞仪(长沙市微米生物科技有限公司)进行检测,结果以阳性率(%)表示。②治疗方法:一线治疗中顺铂耐受患者采用吉西他滨联合顺铂方案,吉西他滨分别于第1、8天行静脉滴注1000 mg/m2,顺铂于第2天开始分2～3 d静脉滴注,总剂量为70 mg/m2。二线治疗中,采用吉西他滨联合卡铂或紫杉醇(150 mg/m2)联合卡铂方案。PD-1抑制剂应用国产药物(信迪利单抗200 mg、特瑞普利单抗240 mg、替雷利珠单抗200 mg),1次/3周,治疗4周期,治疗期间对患者行血常规监测(1次/3 d),肝肾功能及激素水平监测(1次/周)。每2周期结束后行疗效评估。③缓解与未缓解评价标准:在治疗计划结束1个月后,参照实体瘤疗效评价标准[7]进行评价,完全缓解:肿瘤消失且时间超过1个月;部分缓解:肿瘤缩小超过50%且持续超过1个月;稳定:肿瘤在缩小50%与增大25%之间,且时间持续超过1个月;进展:肿瘤增大超过25%或有新病灶出现。缓解组为完全缓解+部分缓解+稳定患者,未缓解组为进展患者。对缓解组患者随访3个月,出现复发和转移的患者纳入复发组,未出现复发和转移的患者纳入未复发组。

2 结 果

2.1 缓解组与未缓解组患者一般资料比较 100例研究对象中,缓解组患者72例(72.00%),未缓解组患者28例(28.00%)。两组患者性别、年龄比较无统计学差异(均P>0.05),但缓解组患者肿瘤直径小于未缓解组,NKG2A、PD-L1/CD4+和PD-L1/CD8+表达水平均低于未缓解组,两组比较差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 缓解组与未缓解组患者一般资料比较

2.2 NKG2A和PD-L1预测膀胱癌患者免疫治疗后缓解的ROC曲线 经ROC曲线分析可知,膀胱癌患者NKG2A、PD-L1/CD4+和PD-L1/CD8+表达预测免疫治疗后缓解的AUC值分别为0.771、0.724、0.710;联合诊断的AUC为0.836。见表2(图1)。

图1 NKG2A和PD-L1预测膀胱癌患者免疫治疗后缓解的ROC曲线

表2 NKG2A和PD-L1预测膀胱癌患者免疫治疗后缓解的ROC曲线分析

2.3 复发组与未复发组患者一般资料比较 72例缓解患者中,复发组29例(40.28%),未复发组43例(59.72%)。两组患者性别、年龄以及肿瘤直径之间比较无统计学差异(均P>0.05),但复发组NKG2A、PD-L1/CD4+和PD-L1/CD8+表达水平均高于未复发组(均P<0.05)。见表3。

表3 复发组与未复发组患者一般资料比较

2.4 NKG2A和PD-L1预测膀胱癌患者缓解后复发的ROC曲线 经ROC曲线分析可得,NKG2A、PD-L1/CD4+和PD-L1/CD8+表达预测膀胱癌患者缓解后复发的AUC值分别为0.775、0.740、0.728;联合诊断的AUC为0.874。见表4(图2)。

图2 NKG2A和PD-L1预测膀胱癌患者缓解后复发的ROC曲线

表4 NKG2A和PD-L1预测膀胱癌患者缓解后复发的ROC曲线分析

3 讨 论

膀胱癌是一种泌尿系统恶性疾病,其在泌尿系统恶性肿瘤中,发病率与致死率均处于首位[9-10]。对于肌层浸润性膀胱癌,主要治疗手段是根治性切除手术,但是从临床经验来看,约半数浸润性膀胱癌患者在行根治术后仍会出现术后复发转移[11]。因此结合非手术手段进行膀胱癌治疗是提升治疗效果的重要举措。化疗是其中一种辅助治疗方式,但由于不同个体对于化疗药物的耐受程度和敏感程度不同,导致其治疗效果存在很大差异,尤其是对于高龄患者,其应用局限极大[12]。免疫治疗是一种新兴的恶性肿瘤治疗手段,其具有不良反应小、适应证范围广以及对高龄患者友好等优势,对于肌层浸润性膀胱癌有着重要价值[13]。

细胞免疫是免疫阻断治疗的主导部分。在浸润淋巴细胞中,NK细胞、CD8+T细胞等是最主要的效应细胞,其能够将肿瘤细胞杀灭,降低癌细胞转移风险[14-15]。肿瘤细胞通过释放出抑制性细胞因子,参与细胞免疫应答过程,使其完成免疫逃逸[16]。肿瘤细胞表面PD-L1阳性表达,会使活化T细胞结合PD-1,无法形成有效的第二信号,使肿瘤免疫应答反应无法建立,导致T细胞失能,进一步导致肿瘤细胞逃避宿主攻击,迅速增殖转移[17-18]。PD-L1阻断免疫治疗能够改变肿瘤微环境,使上述免疫逃逸机制被打破,进而恢复T细胞对于癌细胞的免疫效应。有研究发现,膀胱癌患者PD-L1阻断免疫治疗反应性和肿瘤细胞PD-L1蛋白的表达水平之间有相关性,能够通过肿瘤细胞PD-L1蛋白的表达水平对其治疗效果进行有效预测[19-20]。在本研究中,通过比较不同治疗效果的患者的PD-L1蛋白水平发现,治疗后缓解患者治疗前外周血中PD-L1在CD4+T细胞和CD8+T细胞上的表达明显低于未缓解患者,通过ROC曲线发现,其对于患者接受PD-L1阻断免疫治疗后是否缓解有较高的预测价值,敏感性和特异性均较高,这与过往研究结果大体一致[21]。将治疗后缓解患者根据随访结果进行分组发现,相较于未复发组患者,复发组患者PD-L1在CD4+T细胞和CD8+T细胞上的表达水平更高。提示PD-L1表达水平对于患者术后是否发生复发转移也有较高的预测价值,其表达水平越高,发生复发转移的可能性越高。

NKG2A是一种NK细胞抑制性受体,其在健康人群外周血中的表达较低,而在存在慢性抗原刺激时,其表达会明显上调[22-23]。该受体能够参与形成异二聚体,结合相应的分子复合物进行抑制信号传导,使NK细胞的活性受到明显抑制[24]。新研究发现,将CD8+T细胞表面NKG2A受体进行阻断,能够提升肿瘤的治疗效果,提示NKG2A受体在CD8+T细胞表面的表达水平对于恶性肿瘤治疗反应性有一定的影响[25]。在本研究中,NKG2A在缓解组患者外周血中表达水平低于未缓解组患者,复发组患者外周血中表达水平高于未复发组,提示NKG2A表达水平对于肌层浸润性膀胱癌患者PD-L1阻断免疫治疗反应性有重要价值。通过ROC曲线分析发现,NKG2A表达水平对于治疗反应性的预测价值高于PD-L1/CD4+和PD-L1/CD8+的预测效能,其对于治疗效果的预测敏感性和特异性分别为64.3%和83.3%,其对于缓解后出现复发的预测敏感性和特异性分别为72.4%和65.1%。联合三者预测发现,NKG2A、PD-L1/CD4+和PD-L1/CD8+对于肌层浸润性膀胱癌患者治疗反应性的预测效能高于单项指标的预测效能。

综上所述,NKG2A、PD-L1/CD4+和PD-L1/CD8+在不同治疗反应性肌层浸润性膀胱癌患者外周血中表达水平不同,三者对于膀胱癌患者PD-L1阻断免疫治疗反应性均有一定的预测价值,且三者联合预测效能最佳。