LncRNA-HAGLROS调控miR-26b/JAK2/STAT3通路对肝癌细胞上皮间质转化的影响

李肖芸 方家远 闫春雷 宋华勇

肝癌是肝硬化、慢性肝病等患者中常见的死亡诱因[1-2]。目前肝癌患者的死亡率仍在继续增长[3]。目前认为,肝癌诱发的危险因素主要与以下因素存在关系,如饮酒、超重、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的慢性感染、吸烟等[4]。临床上常采用手术切除术、肝移植方式进行治疗,但总体疗效欠佳,大部分患者术后存在复发或转移,严重影响术后恢复[5]。因此,对于肝癌患者的治疗,积极寻找有效治疗方案尤为重要。HAGLROS可参与多种肿瘤疾病的发生和发展,如结直肠癌[6]、胃癌[7]、肺癌[8]及骨肉瘤[9]等。如吴鹏的研究中[10],HAGLROS在胃癌患者中的表达明显上升,且患者预后较差,HAGLROS可以促进胃癌疾病进展,如增殖和侵袭等。又有研究称[11],HAGLROS可参与直肠癌细胞凋亡、自噬等过程。还有研究发现[12],HAGLROS在肝癌患者中的表达也出现明显异常。因此,关于HAGLROS的分子机制有待进一步研究。miR-26b为常见抑瘤基因,在多种肿瘤疾病中表达均异常。最近研究称[13],miR-26b可与部分LncRNAs竞争性结合,参与肿瘤发展。本次研究主要基于细胞实验探寻HAGLROS和miR-26b在肝癌中的作用,现将内容报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

细胞:正常肝细胞系LO2及肝癌细胞系(Hep3B、MHCC-LM3、Huh7、SMMC-7721)。试剂:脂质体转染试剂Lipofectamine 3000,RPMI 1640培养基,实时荧光定量PCR试剂盒、逆转录试剂盒,MTT增殖检测试剂盒,E-Cadherin、N-cadherin、FN、Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3一抗抗体,HRP标记的二抗抗体,miR-126b抑制剂(inhibitor)、HAGLROS干扰序列,qPCR引物,pmirGLO reporter检测试剂盒,荧光检测试剂盒等。

1.2 细胞培养

细胞复苏,接种于培养基,加10%胎牛血清、1%双抗,置于恒温培养箱内进行培养,环境条件为37 ℃、5% CO2,依据细胞生长情况换液处理。分别将si-NC、si-HAGLROS、miR-26b inhibitor与Lipofectamine 3000混合处理,室温环境下培养,15 min后进行细胞转染操作,观察细胞生长情况,待进入至对数生长期后,予以适量0.25%胰蛋白酶溶液传代,预转染细胞生长至50%,更换无血清培养基。分组,即si-NC组、si-HAGLROS组、miR-26 inhibitor组、si-HAGLROS+miR-26 inhibitor组。

1.3 MTT实验

获取对数期细胞,每孔1×104个接种至96孔板,生长至80%,转染,每组设3个重复,于转染0 h、24 h、48 h、72 h后予以5 μg/μl MTT,孵育,4 h后,终止反应。酶标仪检测吸光度。再以空白孔作为对照,检测各组细胞增殖活性。

1.4 细胞划痕实验

依据5×105个/ml接种至6孔板,采用无菌枪头划痕,倒置显微镜拍照,细胞置于无血清培养基培养,再将其置于恒温培养箱内培养,环境条件为37 ℃、5% CO2,24 h后,采用倒置显微镜观察细胞划痕情况,并进一步计算划痕率。

1.5 细胞侵袭实验

取Transwell小室,水化包被好,重悬,密度1×105个/孔接种,下室予以10%胎牛血清培养,24 h后,取出小室,予以4%多聚甲醛溶液进行固定操作,30 min后,室温环境下风干处理,予以适量结晶紫溶液染色,采用显微镜观察。

1.6 qPCR法

转染48 h后,TRIzol试剂提取总RNA,分析RNA质量,反转录操作,合成cDNA。反应条件如下,95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,40 cycles,60 ℃ 30 s。内参物均为GAPDH,miR-26b内参为U6,采用2-△△Ct计算。HAGLROS上游引物序列:5'-GGAAGGGCTCCTTACTTTC-3',HAGLROS下游引物序列:5'-GGAGGCTTTATCCCA-GTTC-3';E-Cadherin上游引物序列:5'-GGAACGCTCTC-GGTTATTC-3',E-Cadherin下游引物序列:5'-GGCTCTAACTATGTCGGTC-3',FN上游引物序列:5'-GAAGTCCGTTCGCTGATTC-3',FN下游引物序列:5'-GATTCTCCGATGCTAGGTC-3',Bcl-2上游引物序列:5'-GAATCCGTAGCGTCTGTTC-3',Bcl-2下游引物序列:5'-GACGTAGCCTCTTGTGATC-3',GAPDH上游引物序列:5'-GAACGTATGGTGCTCTCTC-3',GAPDH下游引物序列:5'-GACTCGCCGTGTGTAATTC-3',U6上游引物序列:5'-GAAGATTGCTGTTCTCCGC-3',U6下游引物序列:5'-GAACTCCTTGTGGATTCGC-3',miR-126b上游引物序列:5'-GATCCTAGATTCGCTGTGC-3',miR-126b下游引物序列:5'-GATGTTCATCAGCGCTTGC-3'。

1.7 免疫蛋白印迹实验(Western blot,WB)

转染48 h后提取各组细胞总蛋白应用BCA法测定蛋白浓度。各组分别取等量的样本进行SDS-PAE凝胶电泳后,将蛋白转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭,加入E-Cadherin(1∶200)、N-cadherin(1∶200)、FN(1∶100)、Bcl-2(1∶100)、p-JAK2(1∶100)、p-STAT3(1∶200)抗体,4 ℃过夜。应用TBST洗膜3次,每次10 min。接着加入二抗在室温温育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min,加ECL发光剂,X线片曝光、显影、定影。

1.8 双荧光素酶报告基因

miR-26b、HAGLROS序列片段扩增,构建荧光报告质粒pHAGLROS、突变质粒pMut-HAGLROS,将miR-26b mimics、miR-NC与野生或突变质粒转染,24 h后,收集。双荧光报告基因试剂盒检测。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 不同细胞内HAGLROS、miR-26b表达的差异性

肝癌细胞系Hep3B、MHCC-LM3、Huh7、SMMC-7721中HAGLROS表达均显著高于LO2细胞,差异均具有统计学意义(P<0.05),而肝癌细胞系Hep3B、MHCC-LM3、Huh7、SMMC-7721中miR-26b表达均显著低于LO2细胞,差异均具有统计学意义(P<0.05)。由于SMMC-7721细胞中HAGLROS表达最高,因此,后续研究均采用SMMC-7721细胞进行实验。见表1。

表1 不同细胞内HAGLROS、miR-26b表达的差异性

2.2 HAGLROS、miR-26b转染效率

与未转染的SMMC-7721细胞、转染si-NC SMMC-7721细胞比较,分别转染干扰序列HAGLROS-1、si-HAGLROS-2后,SMMC-7721细胞中HAGLROS表达均出现明显下降趋势,差异具有统计学意义(P<0.05),其中si-HAGLROS-1感染后下降率更低,因此,后续实验选取si-HAGLROS-1序列干扰SMMC-7721细胞。见表2。与未转染的SMMC-7721细胞、转染si-NC SMMC-7721细胞比较,转染干扰序列 inhibitor后,SMMC-7721细胞内miR-26b水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。说明转染实验成功。

表2 HAGLROS转染效率

表3 miR-26b转染效率

2.3 HAGLROS与miR-26b的靶向关系

采用生物信息学软件显示,HAGLROS与miR-26b存在互补核苷酸序列,见图1。荧光酶报告基因实验表示,与miR-NC组比较,miR-26b-5p mimics组活性更低,P<0.05;转染突变型HAGLROS,miR-NC组与miR-26b-5p mimics组荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。与对照组、si-NC组进行比较,si-HAGLROS组miR-26b水平均显著更高,差异具有统计学意义(P<0.05),见表5。

图1 靶向结合核苷酸序列

表4 相对荧光强度

表5 miR-26b相对表达量

2.4 SMMC-7721细胞增殖变化

细胞转染0 h、24 h后,si-NC组、si-HAGLROS组、miR-26b inhibitor组、si-HAGLROS+miR-26b inhibitor组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);转染48 h、72 h后,与si-NC组比较,si-HAGLROS组细胞增殖活性下降,miR-26b inhibitor组与之相反,si-HAGLROS+miR-26b inhibitor组与si-HAGLROS组比较,P<0.05。si-NC组与si-HAGLROS+miR-26b inhibitor组细胞增殖活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 SMMC-7721细胞增殖变化

2.5 SMMC-7721细胞迁移变化

与si-NC组比较,si-HAGLROS组细胞划痕愈合率更低,miR-26b inhibitor组细胞划痕愈合率更高,同时si-HAGLROS+miR-26b inhibitor组细胞划痕愈合率明显高于si-HAGLROS组(P<0.05)。si-NC组与si-HAGLROS+miR-26b inhibitor组细胞划痕愈合率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表7。

表7 SMMC-7721细胞划痕愈合率

2.6 SMMC-7721细胞侵袭变化

与si-NC组比较,si-HAGLROS组细胞穿膜数目更低,miR-26b inhibitor组细胞穿膜数目更高,同时si-HAGLROS+miR-26b inhibitor组细胞穿膜数目明显高于si-HAGLROS组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。si-NC组与si-HAGLROS+miR-26b inhibitor组比较,P>0.05。见表8。

表8 细胞穿膜数目个)

2.7 EMT相关因子变化

与si-NC组比较,si-HAGLROS组N-cadherin、FN、Bcl-2表达更低,E-Cadherin表达更高,miR-26b inhibitor组E-Cadherin表达更低,N-cadherin、FN、Bcl-2表达更高,同时si-HAGLROS+miR-26b inhibitor组N-cadherin、FN、Bcl-2表达明显高于si-HAGLROS组,E-Cadherin明显低于si-HAGLROS组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。si-NC组与si-HAGLROS+miR-26b inhibitor组E-Cadherin、N-cadherin、FN、Bcl-2比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表9。

表9 EMT相关因子变化

2.8 JAK2/STAT3通路因子变化

与si-NC组比较,si-HAGLROS组p-JAK2、p-STAT3表达更低,miR-26b inhibitor组p-JAK2、p-STAT3表达更高,同时si-HAGLROS+miR-26b inhibitor组p-JAK2、p-STAT3表达明显高于si-HAGLROS组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。si-NC组与si-HAGLROS+miR-26b inhibitor组p-JAK2、p-STAT3比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表10。

表10 JAK2/STAT3通路因子变化

3 讨论

研究称,肿瘤细胞发生侵袭和迁移是肿瘤恶化的前提条件[14]。EMT主要参与细胞转移[15]。研究称[16],EMT过程中,E-Cadherin表达异常下调,可引起极性下降,甚至丧失,上皮表型转化为间质表型,N-cadherin、FN表达异常上调,促使肿瘤细胞迁移能力和侵袭能力增强。转移前提为细胞获取基质样特性。多项研究均表明[17],LncRNAs调控EMT,参与肿瘤发展。Zhang等研究[18]发现高转移性肝癌患者SNHG3活性激活后,一定程度上可促进肝癌细胞的侵袭能力,还可调控EMT过程。又有研究称[19],DANCR可通过海绵作用与miR-27a-3p结合,进而调节EMT过程,促进肝癌疾病进展。又有研究称[20],ID2-ASI阻断HDAC8与ID2结合,调节ID2基因转录,进一步对EMT过程发挥调节作用,最终控制肝癌细胞的转移。

多项研究均证实[21],LncRNA可竞争性内源RNA,作为miRNAs分子海绵,参与肿瘤疾病的发生和发展。本次研究结果发现,HAGLROS在肝癌细胞系中的表达明显高于正常肝细胞系,说明HAGLROS可能参与了肝癌的发生和发展。本次研究还发现,miR-26b在肝癌细胞系中的表达较正常肝细胞的表达更低。生物信息学软件显示,HAGLROS与miR-26b具有靶向关系,说明HAGLROS与miR-26b存在靶向调控的关系。实验证实,HAGLROS可调控miR-26b表达,且为负性调控。进一步进行细胞功能实验发现,干扰HAGLROS表达后,细胞增殖活性、侵袭能力及迁移能力均明显下降,同时EMT活性也下降,而沉默miR-126b表达后,细胞增殖、侵袭及迁移增强,EMT活性增加;干扰HAGLROS,沉默miR-126b,原本干扰HAGLROS表达后细胞增殖活性、侵袭能力及迁移能力下降而重新被激活。研究称[22],HAGLROS通过miR-100/ATG14或PI3K/AKT/mTOR信号通路,影响鼻咽癌细胞自噬。又如Ye等的研究中[23],HAGLROS在肝癌组织中表达是健康组织的2.3倍。研究称,肝癌内HAGLROS表达与肿瘤临床分期、分化程度有关;HAGLROS可竞争性结合miR-5095,参与凋亡过程。上述研究均进一步表明HAGLROS参与肝癌的发生和发展。

JAK2/STAT3通路可参与多种肿瘤疾病。JAK2/STAT3通路与细胞生长、分化、凋亡有关。STAT3属于一类致癌因子,可激活下游靶基因活性,进而参与细胞增殖,抑制凋亡,促进肿瘤发展。本研究结果显示,干扰HAGLROS后,Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3水平均明显下降,而沉默miR-126b表达后,Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3水平均明显上升,但干扰HAGLROS表达且同时沉默miR-126b表达后,因干扰HAGLROS表达Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3水平下降而又开始上升。此项研究结果说明HAGLROS可以通过靶向调控miR-126b,进而抑制JAK2/STAT3通路活性。

综上所述,LncRNA-HAGLROS可通过靶向下调miR-26b促进肝癌细胞生物行为,如迁移、侵袭及EMT过程,同时可调控JAK2/STAT3通路活性,LncRNA-HAGLROS可作为肝癌治疗靶点。但是本次研究也存在一些局限性,本研究仅仅在细胞层面探讨了HAGLROS在肝癌中的作用,期待后续进行临床研究以探讨HAGLROS是否可作为肝癌预后标志物以及是否可作为肝癌患者治疗靶点。