叶面喷施吲哚乙酸对小花南芥和玉米间作富集铅的影响

肖峰，刘才鑫，祖艳群，王磊，李祖然，王吉秀

（云南农业大学资源与环境学院，昆明 650201）

超富集植物与作物间作修复技术因具有生态环保的边生产边修复的优势，逐渐成为重金属污染土壤修复的主要农艺措施之一。但间作植物提取土壤重金属技术在修复效率方面存在局限性。超富集植物适应重金属离子浓度高的生境土壤，而高背景重金属污染土壤抑制作物的生长发育，影响间作超富集植物与作物的生物量，导致间作修复效率往往并不理想[1]。因此在超富集植物与作物间作体系下促进超富集植物吸收累积重金属的同时，如何保证提高间作植物生物量、减少重金属累积，是利用间作植物提取土壤重金属取得成功的关键。植物激素吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）是植物体内合成的调控植物生长发育、影响生理生化、促进细胞分裂和根系伸长的微量有机物质[2]。有研究证明，超富集或耐性植物能通过合成更多IAA来抵御重金属的胁迫[3]。

在重金属胁迫下，叶面喷施IAA 通过超富集植物与作物间作体系来调控植物生长，改善重金属的富集特征。研究表明IAA 通过增强植物的蒸腾作用促进植物根系吸收和转运重金属[4-5]，推测机理是植物激素引起植物抗氧化酶代谢变化或IAA 与不同植物体内结合受体发生变化，如受体ABP（Auxin-binding proteins）的结合可以调节质膜上的H+-ATPase 活性，引起质膜上K+、Na+、Ca2+离子通道的开放或激活细胞质膜离子转运蛋白[5]。重金属胁迫下IAA转化为结合态维持植物正常生理机能，如拟南芥中结合态IAA是自由态的38倍[6]，双子叶植物的结合态IAA为IAA-酰胺[7]、IAA-糖[8]、IAA-谷氨酸、IAA-PCs 和IAA-天冬氨酸[9]。高浓度（1、10 μmol·L-1）IAA 可以调节浮萍淀粉的积累，增强淀粉合成关键酶ADPG焦磷酸化酶（AGPase）的活性，淀粉含量和AGPase 活性在10 μmol·L-1的IAA处理下分别比对照显著增加35.0%和14.1%[10]。As 超富集植物大叶井口边草的内源生长素含量显著高于非As超富集植物剑叶凤尾蕨[11]，As耐性芥菜体内硫酸盐、生长素和茉莉酸盐含量以及合成途径的基因表达量显著高于As敏感性芥菜[12]。

本研究将植物激素IAA 引入到间作体系下修复重金属污染土壤，在间作超富集植物和玉米叶片上喷施IAA，探究IAA 在植物生理生化方面的功能。IAA的作用主要包括：①促进植物的生长发育，稀释重金属在植物体内的浓度，从而提高植物对重金属的耐性；②IAA 进入间作不同植物体内与结合受体发生螯合，缓解重金属的胁迫。但目前Pb 胁迫下IAA 如何影响间作超富集植物小花南芥和作物玉米对Pb的富集特征尚不清楚，有待进一步探索研究。因此本研究设置超富集植物小花南芥、玉米单作、小花南芥与玉米间作三种种植模式，通过叶面喷施不同浓度IAA，探讨IAA 对间作体系下超富集植物与玉米修复土壤Pb 污染的调控作用，对于解决超富集植物与作物间作修复Pb污染土壤具有重要的理论意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小花南芥是云南省会泽铅锌矿野生物种，十字花科，南芥属，多年生草本植物。玉米品种选用“会单4号”，属于Pb低累积品种。

1.2 试验设计

试验于云南农业大学后山进行，采用小花南芥和玉米间作、单作3 种模式，每种模式4 个处理，3 次重复，共计36 盆（58 cm×33 cm×18.5 cm）。土壤采用云南农业大学后山土壤与基质土混合的方式，后山土壤经自然风干后过2 mm 筛，基质土由昆明当地的公司生产，准确称量9 kg 后山土壤与3 kg 基质土，混合后装入盆中，Pb 以Pb（CH3COO）2溶液的形式与土充分混合均匀，准确称取21.9 g Pb（CH3COO）2·3H2O（Pb2+含量约为1 000 mg·kg-1）溶于500 mL 水中，倒入混合土壤中，手动搅拌至土壤全部潮湿且无成团后，放置平衡15 d，移栽小花南芥和玉米幼苗。小花南芥与玉米之间的间作距离保持8 cm，小花南芥与玉米单作时，两棵苗之间距离保持8 cm。设置外源喷施IAA的浓度为0 mg·L-1（CK）、25 mg·L-1（T1）、50 mg·L-1（T2）、100 mg·L-1（T3）。每两日喷施一次，60 d后取样。

1.3 指标测定

1.3.1 土壤基本理化性质

土壤Pb 含量（原土加Pb2+之后土壤Pb 含量）、速效磷、速效钾、有机质、碱解氮、pH 的测定参照鲍士旦《土壤农化分析》（第三版）[13]，结果见表1。

表1 实验用土基本理化性质Table 1 Basic physical and chemical properties of the test soil

1.3.2 植物抗氧化酶、丙二醛、光合色素

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）三种抗氧化酶活性，以及丙二醛（MDA）、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量的测定采用试剂盒方法，试剂盒购于苏州格锐思生物科技有限公司，根据试剂盒方法，采用紫外分光光度计读数。

1.3.3 植物生物量

将收集好的植物样洗净装入信封中并编号，放入烘箱105 ℃杀青30 min，调节烘箱温度到75 ℃烘干至恒质量，冷却后取出，测定其生物量。

1.3.4 植物光合作用

使用Li-6400光合荧光记录仪（Li-Cor）测定净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率。使用CO2注入系统，CO2浓度控制为400 μmol·mol-1，夹上叶片后于1 200 μmol·m-2·s-1光强下测量。

1.3.5 植物Pb含量

称取0.2 g 的植物干样，倒入消煮罐中，加4 mL硝酸过夜，隔夜加入2 mL 30%过氧化氢，将消煮罐放入烘箱（DHG-9145A），140 ℃加热4 h，取出冷却定容，用火焰原子吸收分光光度计（Thermo ICETM3300AAS，美国）测定。

1.3.6 Pb富集、转运系数

Pb的富集、转运能力按下列公式计算：

富集系数=植株Pb 含量（mg·kg-1）/土壤Pb 含量（mg·kg-1）

转运系数=植株地上部分Pb 含量（mg·kg-1）/植株地下部分Pb含量（mg·kg-1）

1.4 数据分析

数据通过Excel和SPSS进行处理，采用Tukey法进行统计分析，显著性检验设α=0.05，多重比较结果以小写英文字母表示。利用软件Origin 8.6 制图，用SPSS 12.0统计软件对试验数据进行双因素方差分析和最小显著差法（LSD）显著性检验，显著性水平α=0.05。

2 结果与分析

2.1 不同浓度IAA 处理下间作小花南芥与玉米生物量的变化

IAA 作为植物生长素可以促进植物伸长生长。如图1 所示，间作小花南芥生物量高于单作，与单作相比，T3 处理下间作地上部分生物量显著增加195.0%，地下部分则在T1、T2 处理下显著增加80.1%和25.5%。间作玉米地上部分在T2、T3 处理下比单作显著增加15.0%和31.9%，而地下部分的生物量小于单作。由此可以说明，IAA 主要促进小花南芥的根部伸长，这有利于小花南芥对土壤中Pb的富集；而对于玉米来说，外源施加IAA在间作体系下更加有利于地上部分的生长，增加玉米对Pb 的耐受性。双因素结果分析表明，IAA 处理和种植模式对小花南芥和玉米的生物量均有极显著影响，且两种因素存在交互作用。

2.2 不同浓度IAA 处理对间作小花南芥与玉米SOD活性的影响

SOD是消除植物体内ROS的首要物质，SOD活性越强表明植物抵抗重金属胁迫的能力越强。如图2所示，与单作小花南芥相比，间作小花南芥叶片SOD活性在T1、T2 处理下显著提高42.1%和65.4%（P＜0.05），间作根部在T1、T2 处理下显著提高27.7%和29.9%（P＜0.05）。间作玉米在T1 和T3 处理下叶片SOD 活性较单作提高40.1%和37.1%（P＜0.05）。在3种浓度处理下间作玉米根部SOD 活性则较单作显著提高21.4%、11.8%和12.1%。双因素结果分析表明，IAA 处理和种植模式对小花南芥叶片SOD 活性有极显著影响，且两者存在交互作用，对玉米SOD 活性有极显著影响，且两者存在交互作用。

图2 不同浓度IAA处理对小花南芥和玉米SOD活性的影响Figure 2 Effects of different concentrations of IAA on SOD activity of Arabis alpina and maize

2.3 不同浓度IAA 处理对间作小花南芥与玉米POD活性的影响

POD可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。如图3 所示，间作小花南芥POD 活性较单作显著提升，其叶片POD 活性在3 种浓度处理下较单作分别提高20.3%、36.5%和25.7%，根部较单作分别提高12.0%、37.1%和54.0%（P＜0.05）。间作玉米SOD 活性较单作显著提升，间作叶片在3 种浓度处理下分别提高44.4%、23.0%和23.1%，间作根部SOD 活性较单作分别提高27.4%、25.8%和17.7%（P＜0.05）。双因素分析结果表明，IAA 处理和种植模式对小花南芥与玉米POD 活性均有极显著影响，且两者存在交互作用（玉米叶片和小花南芥根除外）。

图3 不同浓度IAA处理下小花南芥和玉米的POD活性Figure 3 Effects of different concentrations of IAA on POD activity of Arabis alpina and maize

2.4 不同浓度IAA 处理对间作小花南芥与玉米CAT活性的影响

CAT可以将H2O2催化成O2和H2O，从而减轻重金属对植物的胁迫。如图4 所示，间作小花南芥叶片在3 种浓度处理下CAT 活性较单作分别显著提高21.8%、15.2%和36.0%，小花南芥根部在T1 处理下较单作显著提高41.9%（P＜0.05）。间作玉米叶片CAT活性在T1 处理下较单作显著提高50.0%，根部则在3 种浓度处理下较单作分别显著提高36.8%、32.8%和16.3%（P＜0.05）。双因素分析结果表明，IAA处理和种植模式对小花南芥和玉米的CAT 活性均有极显著影响，且两种因素存在交互作用（小花南芥叶片除外）。

图4 不同浓度IAA处理下小花南芥和玉米的CAT活性Figure 4 Effects of different concentrations of IAA on CAT activity of Arabis alpina and maize

2.5 不同浓度IAA 处理下间作小花南芥与玉米的MDA含量

丙二醛（MDA）反映植物细胞过脂化程度，MDA含量越低植物受重金属胁迫的程度越低。如图5 所示，间作小花南芥的MDA 含量在3 种浓度处理下均显著低于单作处理。与单作相比，间作小花南芥叶片MDA 含量在3 种浓度处理下分别降低25.8%、40.7%和43.3%，根部MDA 含量分别降低98.9%、58.6%和57.4%（P＜0.05）。如图5 所示，间作玉米叶片MDA 含量在3 种处理下分别较单作降低10.9%、27.2%和12.1%，间作根部MDA 含量在T1、T2 处理下分别较单作降低26.1%和19.4%（P＜0.05）。双因素分析结果表明，IAA 处理和种植模式对小花南芥与玉米MDA 含量有极显著影响，且两者存在交互作用。

图5 不同浓度IAA处理下小花南芥和玉米的MDA含量Figure 5 Effects of different concentrations of IAA on MDA content of Arabis alpina and maize

2.6 不同浓度IAA 处理下间作小花南芥与玉米的光合特性

IAA 通过促进植物的光合作用来减轻重金属对植物的胁迫[14]。如表2所示，在T1处理下的单作小花南芥净光合速率、气孔导度较对照分别提高12.7%和70.6%，间作较对照分别提高33.4%和135.7%。T1 处理下间作小花南芥蒸腾速率较对照提高49.1%（P＜0.05）。而T3 处理下小花南芥光合特性出现降低的趋势，单作和间作小花南芥净光合速率较各自对照分别降低了41.3%和16.2%（P＜0.05）。小花南芥胞间CO2浓度升高，其中T3 处理单作升高4.2%，间作升高3.8%（P＜0.05），由此说明T1 浓度可以促进小花南芥光合作用，而继续增加浓度会出现抑制效果。双因素分析结果表明，IAA 处理和种植模式对小花南芥光合特性有极显著影响，且两者存在交互作用。

表2 不同浓度IAA处理下小花南芥的光合特性Table 2 Photosynthetic characteristics of Arabis alpina treated with different concentrations of IAA

如表3 所示，叶面喷施IAA 会显著增加玉米的光合作用，其中在T3处理下的间作玉米净光合速率、气孔导度和蒸腾速率较对照显著增加153.0%、100.0%和117.6%，较单作显著增加18.7%、27.3%和28.6%。其中间作玉米在T3 处理下胞间CO2浓度较对照降低52.0%，较单作降低65.3%。由此说明T3 处理下的间作玉米光合作用达到最优效果。双因素分析结果表明，IAA 处理和种植模式对玉米的净光合速率、胞间CO2浓度、蒸腾速率有显著影响，且两者存在交互作用。IAA 处理对玉米气孔导度有极显著影响，两者存在交互作用。

表3 不同浓度IAA处理下玉米的光合特性Table 3 Photosynthetic characteristics of maize treated with different concentrations of IAA

2.7 不同浓度IAA 处理下间作小花南芥与玉米的光合色素含量

由表4可知，间作小花南芥在T2处理下叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量较单作增加9.7%、176.5%和280.8%，较间作对照增加78.7%、58.4%和53.7%。而在T3处理下的小花南芥叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均低于对照（P＜0.05）。双因素分析结果表明，IAA 处理和种植模式对小花南芥的光合色素含量有极显著影响，且两者具有交互作用。

表4 不同浓度IAA处理下小花南芥光合色素含量Table 4 Photosynthetic pigment content of Arabis alpina treated with different concentrations of IAA

如表5 所示，玉米在3 种IAA 浓度处理下光合色素含量呈先升高后降低趋势。T2 处理下的单作和间作玉米叶绿素a 含量较各自对照分别增加147.9%和61.0%。单作玉米叶绿素b 在T2 处理下比对照增加了165.3%，间作玉米叶绿素b 在T1 处理下较对照增加了117.6%。单作玉米的叶绿素a/b 表现为先升高后降低，这说明IAA 对叶绿素a 的影响小于叶绿素b。而间作玉米的叶绿素a/b 表现为先降低后升高，说明IAA 对叶绿素a 影响大于叶绿素b。单作和间作玉米的类胡萝卜素含量在T2处理下比各自对照分别增加73.2%和92.0%，其中间作玉米的类胡萝卜素含量在T2 处理下较单作增加77.8%。这说明IAA 缓解了重金属对玉米类胡萝卜素的影响，间作体系要优于单作。双因素分析结果表明，IAA 处理和种植模式对玉米的叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素含量有极显著影响，且两者具有交互作用。

表5 不同浓度IAA处理下玉米光合色素含量Table 5 Photosynthetic pigment content of maize treated with different concentrations of IAA

2.8 不同浓度IAA 处理下间作小花南芥与玉米的重金属含量

由表6 可知，小花南芥地上部分Pb 含量在3 种IAA 浓度处理下表现为低促高抑，其单作和间作地上部分在T1 处理下相较于CK 分别增加32.4% 和19.8%，而间作较单作在T1 处理下增加15.6%。小花南芥的富集系数也表现为先升高后降低，间作条件下显著高于单作。间作条件下小花南芥转运系数显著低于单作处理。双因素分析结果表明，IAA 处理和种植模式对小花南芥的Pb 含量有极显著影响，但两者除富集系数外无交互作用。

表6 不同浓度IAA处理对小花南芥Pb含量的影响Table 6 Effects of IAA at different concentrations on Pb content in Arabis alpina

由表7 可知，3 种IAA 浓度处理下的单作玉米Pb含量地上部分变化不显著，而地下部分显著增加，T2处理最高，较对照增加49.9%。间作玉米地上部分和地下部分Pb含量均表现为先增加后降低。单作玉米的富集系数在3 种浓度处理下均比对照显著提高，间作玉米的富集系数表现为先升高后降低。单作玉米的转运系数在T2、T3处理下均降低，这说明高浓度的IAA抑制了玉米根系吸收Pb。双因素分析结果表明，IAA 处理和种植模式对玉米的Pb 含量有极显著影响，且两者具有交互作用。

表7 不同浓度IAA处理对玉米Pb含量的影响Table 7 Effects of IAA at different concentrations on Pb content in maize

3 讨论

IAA 属于植物生长素，能够调控植物的生长发育，如促进细胞伸长、分裂、扩张和分化等[15]。本研究发现玉米和小花南芥的生物量受叶面喷施IAA浓度的影响，IAA 处理使其地上部分生物量增加，浓度增加后则变化不明显。另外对比研究发现，在相同浓度IAA 的处理下，间作体系下的小花南芥与玉米的生物量要大于单作。间作体系下的玉米受到重金属的胁迫会减弱，从而生长得更好。

重金属Pb 进入植物体内会刺激植物体内产生ROS，为减少ROS 对植物结构细胞损伤，植物细胞会启动抗氧化酶系统来消除过量的氧离子和过氧化物以及含氧自由基[16]。IAA 作为植物激素可以通过增加抗氧化酶活性和降低MDA 的含量来消除过量的ROS[17]。本研究中玉米和小花南芥在3 种IAA 浓度下，其间作体系的SOD、POD、CAT 活性比单作均显著提高。MDA 是膜脂过氧化的产物，其含量的大小可以反映植物受到重金属胁迫的程度。研究发现，植物生理生化指标对外源IAA 的响应受到IAA 浓度的影响，其生理作用具有两重性[18]。本研究发现T1、T2 处理下玉米根部的MDA 含量显著降低，但T3 处理下玉米根部MDA 含量与对照差异不显著。这表明IAA 可以通过提高抗氧化酶活性来减轻细胞过氧化的伤害，维持细胞正常生理活性，提高植物耐受性，而继续增加喷施浓度会增加植物体内MDA 含量，抗氧化酶的活性也会随之下降。

Pb 对植物的胁迫作用导致细胞过氧化，从而破坏植物叶绿体膜，影响叶绿素含量，改变气孔导度和光合特性[19]。本试验发现叶面喷施IAA 后，玉米的光合速率、气孔导度、蒸腾速率显著上升，胞间CO2浓度降低，且IAA对间作体系下玉米光合作用的改善要优于单作。IAA 浓度对光合色素含量的影响表现为低促高抑，这可能是由于高浓度的IAA会抑制植物体内光合色素的合成。另外不同植物对IAA 浓度的响应程度也不同，在3 种浓度下，小花南芥光合作用和光合色素的强度均表现为先增强后抑制，玉米的光合特性表现为增强。本研究还发现高浓度IAA 处理下光合作用减弱，而生物量却在较低浓度IAA 处理中增加，这可能由于玉米和小花南芥在喷施前期生长较快，导致后期喷施的IAA 达不到促进植物生长的效果，抑制植物的光合作用，而低浓度IAA 对植物生长的促进作用没有高浓度IAA效率高，使植物在喷施后期仍处于生长阶段，从而造成了这一现象。因此，叶面喷施一定浓度的IAA 会降低Pb 对叶片叶绿素和光合特性的影响，维持光合作用的正常进行。

有研究发现，IAA 可以促进龙葵[20]、菹草（Potamogeton crispus）和凤眼蓝（Eichhornia crassipes）[21]等超富集植物对重金属的吸收。本课题组前期试验发现小花南芥作为超富集植物，其富集系数和转运系数均大于1[22]。本研究发现小花南芥在外源施加IAA 后，其间作体系下的富集系数显著提高，但富集系数未达到1，这可能受多方面因素影响，如土壤的理化性质、Pb形态、气候条件等，课题组前期试验的小花南芥土壤取自会泽铅锌矿区生长的含有Pb 污染的原土，本次试验土壤取自云南农业大学后山荒山土壤，外源添加Pb 进行盆栽试验，大棚里温度较高，每日浇水保持土壤持水量，以供植物生长，故Pb富集系数较低。转运系数降低可能是由于IAA 与小花南芥地上部分受体结合占据某些Pb 的位点。施加IAA 可以显著提高玉米的耐受性，增加地下部分对重金属的吸收，为边修复边生产提供了思路。然而在间作小花南芥和玉米喷施IAA的试验中发现，作物玉米体内重金属含量较空白显著增加，对玉米已经造成安全风险。其原因可能是试验中土壤重金属含量远高于《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618—2018）中Pb 的管制值（当5.5＜pH≤6.5 时，Pb 的管制值为500 mg·kg-1），导致玉米植株体内重金属含量较高。但本试验研究的是小花南芥和玉米的苗期，并未进一步研究玉米的整个生育期，特别是玉米籽粒是否会超标还有待进一步探究。这同时也说明在间作植物修复土壤重金属时，其边生产边修复的思路能否实现生态经济价值，也受到土壤重金属含量、形态的影响。对于高浓度重金属污染的土壤来说，施加IAA在提高超富集植物修复效率的同时，也使作物体内的重金属含量超标，虽然提高了作物耐受性，但是会影响其经济效益。而本试验探究出施加IAA的最优浓度，下一步研究外源施加IAA 在超富集植物与作物间作修复土壤重金属污染的试验中，应探索喷施IAA时间点、喷施部位、土壤重金属浓度和形态等差异对间作植物Pb 富集特征的影响。综上所述，叶面喷施IAA可以调控小花南芥和玉米根系生长、光合特性及Pb富集特征，但IAA 调控间作植物富集Pb 的机理还有待进一步研究。

4 结论

（1）25 mg·L-1IAA 处理下，间作小花南芥和玉米的地上部分生物量较单作显著增加。

（2）浓度为25 mg·L-1和50 mg·L-1的IAA 可以显著提高玉米和小花南芥的抗氧化酶活性，降低MDA含量，增加光合色素含量，而继续将IAA 浓度提高到100 mg·L-1后，其效果减弱。

（3）间作小花南芥对Pb 的富集系数显著高于单作，且喷施IAA 会促进玉米和小花南芥的根对Pb 的富集。因此，利用超富集植物小花南芥与玉米间作修复土壤重金属污染时，施加IAA 可以提高其修复效率，同时还会增强玉米对重金属污染土壤的耐受性。